Trên mô hình động vật thực nghiệm, ghép MSCs đã mang lại những kết quả hứa hẹn, những kết quả này được ứng dụng trên thử nghiệm lâm sàng. Có 96 thử nghiệm lâm sàng được đăng ký pha I và pha II trên bệnh nhân ĐTĐ T2, được ghi nhận trên http://www.clinicaltrials.gov/. Một số các nghiên cứu được tổng hợp trong Bảng 1.2
Năm 2008, Estrada và cộng sự lần đầu tiên kết hợp ghép tế bào gốc trung mô tủy xương kết hợp liệu pháp hyperbaric oxygen therapy (HOT), kết quả cho thấy chỉ số HbA1C giảm có ý nghĩa cho tới một năm [33]. Mức giảm insulin có ý nghĩa thống kê trong nghiên của Bhasali và cộng sự năm 2009 chỉ với một lần truyền BM-MSCs duy nhất [6]. Các yếu tố tiết ra bởi MSCs như VEGF(Vascular Endothelial Growth Factor), IGF-1(Insulin-like Growth Factor -1), và β-FGF (β-Fibroblast Growth Factor) có thể điều hòa vi môi trường của mô bị tổn thương, ức chế sự chết lập trình của tế bào, cải thiện hệ miễn dịch, thúc đẩy hình thành mạch máu mới và tái tạo mô. Ghép MSCs theo đường tĩnh mạch được coi là phương pháp hiệu quả hơn so với ghép tại mô, cơ quan vì MSCs chủ yếu tác động qua cơ chế tiết cytokines – hơn là từ sự biệt hóa của MSCs [110]. Tuy nhiên đường truyền MSCs như thế nào vẫn còn là vấn đề cần làm sáng tỏ. Một số nghiên cứu cho thấy truyền nhiều lần mang lại hiệu quả kiểm soát đường huyết tốt hơn truyền một lần. Nhóm tác giả Bhansali đã thử nghiệm truyền MSCs lần 2 sau lần thứ nhất 12 tuần, kết quả giảm liều Insulin lâu dài hơn gợi ý rằng truyền nhiều lần có hiệu quả tốt hơn truyền một lần [6]. Tuy nhiên cần có nhiều nghiên cứu hơn để khẳng định điều này. Liều truyền của MSCs cũng là một yếu tố chưa xác định. Các thử nghiệm lâm sàng hiện tại cho thấy liều trung bình MSCs là 1 × 106 tới 3 × 106/kg trọng lượng cơ thể. Liều truyền cao cho thấy kết quả HbA1C giảm một cách đáng kể [105]. Tuy nhiên, cũng chưa có nhiều nghiên cứu để khẳng định kết quả liều truyền tối ưu cũng như liều truyền liên quan
hợp được từ tế bào tụy, chỉ số này được định lượng ở 13 thử nghiệm lâm sàng truyền MSCs trên bệnh nhân ĐTĐ T2 đã mang lại hiệu quả cải thiện chức năng tụy rất đáng khích lệ [6], [52], [57], [69], [75], [94], [105], [106], [108], [108], [114], [124]. C-Peptide tăng một cách có ý nghĩa thống kê trong nhóm truyền MSCs so với nhóm chứng, tăng 43.8% so với trước truyền. Trong nghiên cứu của Liu và cộng sự, C-peptide được tìm thấy tăng đỉnh điểm ở 6 tháng, giảm nhẹ ở 12 [6], [75], [115].
Bảng 1.2. Một số các thử nghiệm lâm sàng ứng dụng tế bào gốc trung mô trong điều trị đái tháo đường típ 2.
STT
Số bệnh nhân
Loại tế bào Đường truyền
Phương
pháp Hiệu quả điều trị Tác giả
1 25 MNC kết hợp
HBO Tinh mạch Tự thân
Giảm glucoso lúc đói, HbA1C, Tăng C-peptide, giảm liều insuin.
Estrada và cs, 2008 [33].
2 10 BM-MSC N/A Tự thân Giảm liều dùng insulin. Tăng C-peptide Bhansali và cs, 2009
[12].
3 10 MSC từ nhau
thai Tĩnh mạch N/A
Giảm liều insulin. Tăng C-peptide Chức năng gan, thận được cải thiện
Jiang và cs, 2011 [57]. 4 41 BM-MSC hoặc BM- MNC
Tiêm cơ N/A
BN bị tắc nghẽn mạch máu chi nghiêm trọng và loét bàn chân : Tình trạng đau đớn giảm. Chỉ số bệnh được cải thiện hơn ở nhóm điều trị bằng BM-MSC
Lu và cs, 2011 [77].
6 31 BM-MNCs Động mạch
tụy Tự thân
Giảm FPG, Giảm HbA1C, Tăng C-peptide. Wang và cs, 2011 [109]. 7 30 BM-MSC và TB sửa chữa mô (Tế bào CD90+) Tiêm cơ Ghép tự thân
Điều trị loét bàn chân và tắt nghẽn mạch máu chi nghiệm trọng do ĐTĐ 18/22 bệnh nhân được điều trị lành vết thương sau 45 tuần sau ghép tế bào.
Kirana và cs, 2012 [64].
8 118 BM-MSC Tiêm tụy Ghép tự
thân
HbA1C và C-peptide được cải thiện đáng kể
Hu và cs, 2012 [52].
[124].
10 7 MSC máu
ngoại vi N/A
Ghép tự thân
BM ĐTĐ bị tắt nghẽn mạch máu chi nghiêm trọng sau điều trị: Tình trạng đau đớn giảm. Làm chậm tiến trình tháo khớp
Mohammadzadeh và cs, 2013 [50].
11 21 BM-MSC Tĩnh mạch Ghép tự
thân
Giảm nhu cầu insulin (66,7%), tăng C-peptide sau 12 tháng điều trị.
Bhansali và cs, 2014 [6].
12 12 UC-MSC Tĩnh mạch Ghép tự
thân
Cải thiện nồng độ C-peptide và chức năng tế bào beta, và giảm các dấu hiệu viêm hệ thống và số lượng tế bào lympho T.
Liu và cs, 2014 [74].
13 80 BM-MNC kết
hợp HOT Tĩnh mạch
Ghéo tự thân
Tăng nống độ C-peptide, giảm liều insulin. Wu và cs, 2014 [114].
14 - MNC Tĩnh mạch/
Động mạch
Ghép tự thân
Đáp ứng mạnh mẽ với biểu hiện của FDG khi truyền theo đường động mạch và các đạp ứng tại phổi khi truyền theo đường tĩnh mạch.
Sood và cs,2015 [106].
15 61 BM-MSCs Tĩnh mạch Ghép tự
thân
Giảm liều thuốc, tăng C-peptide. Skyler và cs,2015
[107].
16 18 UC-MSC Tĩnh mạch
Ghép đồng loại
Giảm hiệu quả đường huyết
Tăng sản xuất C-peptide và các tế bào Treg nhưng không có ý nghĩa thống kê (p>0,05)
Cai và cs, 2016 [19].
17 30 BM-MSC và
BM-MNC Tĩnh mạch
Ghép tự thân
Giảm liều insulin, giảm HbA1C ở cả 2 nhóm BM- MSC và BM-MNC so với nhóm chứng.
Bhansali và cs, 2017 [13].
Tại Việt Nam, hiện nay, các nghiên cứu về tế bào gốc đã có nhiều bước tiến quan trọng. Cụ thể, trong những năm gần đây, nghiên cứu về tế bào gốc đã gặt hái được nhiều thành tựu ở nhiều đơn vị như Phòng thí nghiệm Nghiên cứu và Ứng dụng Tế bào gốc, Đại học Y – Dược TP HCM, Đại học Y Phạm Ngọc Thạch, Bệnh viện 108, Bệnh viện Bạch Mai. Một số nghiên cứu cũng được đánh giá rất cao. Bên cạnh đó, từ năm 1997 đến nay, việc ứng dụng liệu pháp tế bào gốc cũng mang lại các kết quả quan trọng trong điều trị một số bệnh như: ghép tế bào gốc điều trị ung thư máu (Bệnh viện Truyền máu- Huyết học, 2004), ghép thành công tế bào gốc tự thân điều trị bệnh xương (Bệnh viện 108, 2010), ghép tế bào gốc điều trị bệnh động mạch vành (Viện tim mạch, 2011), ghép tế bào gốc điều trị bệnh nhồi máu cơ tim, hỗ trợ điều trị ung thư và điều trị các bệnh thị giác (Đại học Y Hà Nội, 2007), ghép tế bào gốc điều trị bệnh khớp và loét bàn chân do ĐTĐ [2].
Nghiên cứu và ứng dụng tế bào gốc trong điều trị bệnh ĐTĐ được xem như là một bước đột phá lớn và mở ra niềm hi vọng cho bệnh nhân bị bệnh ĐTĐ trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng. Theo các công bố trong nước tính đến thời điểm này, việc nghiên cứu thử nghiệm điều trị ĐTĐ bằng công nghệ tế bào gốc đã đạt được một số kết quả nhất định. Khai thác các nguồn tế bào khác nhau để điều trị, một số nhóm nghiên cứu cũng đạt được bước đầu về việc sử dụng tế bào gốc hay tế bào tiết insulin được biệt hóa thành tế bào gốc trong điều trị thử nghiệm mô hình chuột ĐTĐ. Trên các ứng dụng trên người , Phạm Văn Phúc và cộng sự đã bước đầu điều trị đái tháo đường bằng tế bào gốc trung mô tự thân phân lập từ mô mỡ được áp dụng, 3 bệnh nhân ĐTĐ T2 phân lập, nuôi cấy MSCs từ mô mỡ tự thân, kết quả cho thấy giảm mức glucose máu ở tất cả 3 bệnh nhân vào thời điểm 3 tháng sau truyền [70]. Một số các ca lâm sàng cũng được báo cáo từ các trung tâm tế bào gốc khác nhau, có thấy hiệu quả thực sự của tế bào gốc trung mô trong điều trị ĐTĐ T2 [2].
1.3.4. Phản ứng phụ, tác dụng bất lợi của liệu pháp ghép tế bào gốc.
Sự an toàn của bệnh nhân và cân nhắc giữa nguy cơ và lợi ích mà liệu pháp mang lại luôn là điều quan trọng nhất trong thử nghiệm lâm sàng. Vì vậy, các tác dụng phụ, biến cố bất lợi luôn được theo dõi chặt chẽ trong tất cả các thử nghiệm
lâm sàng đánh giá hiệu quả của MSCs trên bệnh nhân ĐTĐ T2. Không có phản ứng miễn dịch hay dị ứng cấp tính nào được ghi nhận trong tất cả 13 thử nghiệm trên người [117]. Sự hình thành mô không mong muốn cũng không được tìm thấy trong các thử nghiệm, một tỷ lệ nhỏ chảy máu, đau tại vị trí truyền và đặt catheter động mạch tụy sau ghép MSCs được báo cáo bởi Wu, Liu, Bhansali và cộng sự [6], [75], [115]. 13 bệnh nhân tương đương 22.2% có triệu chứng sốt nhẹ đến trung bình [68], [121]. Một số triệu chứng như buồn nôn, nôn, đau đầu, đau bụng dưới, và hiếm nhiễm trùng hô hấp trên [53], [73], [92]. Các bằng chứng thử nghiệm lâm sàng trên đã chứng minh sử dụng tế bào gốc nói chung và tế bào gốc trung mô nói riêng trong điều trị ĐTĐ là một liệu pháp an toàn và hiệu quả.
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1.ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Cỡ mẫu
30 bệnh nhân được lựa chọn để tham gia nghiên cứu.
2.1.2. Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân
Bệnh nhân tham gia nghiên cứu được lựa chọn thông qua việc khám sàng lọc tại bệnh viện Đa khoa quốc tế Vinmec và đáp ứng được các tiêu chuẩn lựa chọn và tiêu chuẩn loại trừ như sau:
2.1.2.1.Tiêu chuẩn lựa chọn
- Tiêu chuẩn lựa chọn nhận vào giai đoạn chuẩn bị (10 tuần trước khi lấy tủy xương):
+Tuổi từ 18 trở lên
+Bệnh nhân cả nam và nữ được chẩn đoán xác định là ĐTĐ T2 theo “Hướng dẫn chẩn đoán và điều trị đái tháo đường típ 2” của Bộ Y tế ban hành 2017.
+Bệnh nhân đang sử dụng các thuốc điều trị đái tháo đường (thuốc uống, thuốc tiêm và/hoặc Insulin) với liều lượng ổn định trong 10 tuần.
+Tại thời điểm sàng lọc HbA1C ≥ 7,5% và ≤ 9% và FPG < 10 mmol/L.
+Bệnh nhân không có các bệnh cấp tính nặng nào khác cần được điều trị.
+Bệnh nhân đồng ý sử dụng dịch vụ ghép tế bào gốc để điều trị sau khi đã được các bác sỹ giải thích về lợi ích, các nguy cơ, rủi ro có thể xảy ra.
- Tiêu chuẩn nhận vào truyền tế bào gốc sau giai đoạn chuẩn bị (Tuần 0):
+ Bệnh nhân tuân thủ điều trị sử dụng thuốc trong 10 tuần chuẩn bị với tỷ lệ tuân thủ điều trị từ 80%.
+ HbA1C tại Tuần 0 ≥ 7,5% và ≤ 9%.
2.1.2.2.Tiêu chuẩn loại trừ
- Bệnh nhân có một trong các tiêu chuẩn dưới đây sẽ bị loại khỏi nghiên cứu tại Tuần -10 và Tuần 0:
+ Bệnh nhân đang nhiễm trùng cấp tính, ung thư, bệnh tim, phổi, suy thận, suy gan nặng.
+ Bệnh nhân mắc các bệnh khác, hoặc có các điều kiện, hoàn cảnh khác, theo đánh giá nghiên cứu viên là khó đảm bảo tuân thủ điều trị nghiên cứu.
+ Các bệnh nhân có rối loạn đông máu có ý nghĩa lâm sàng.
+ Tiền sử dị ứng với thuốc gây mê, gây tê, kháng sinh.
2.2.PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.2.1. Thiết kế nghiên cứu 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu
- Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng, nhãn mở, đơn nhóm, so sánh trước và sau điều trị.
2.2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Địa điểm: Viện nghiên cứu Tế bào gốc và Công nghệ Gen Vinmec
- Thời gian: Từ tháng 11/2017 đến tháng 03/2020
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu
Bước 1: Thu tuyển bệnh nhân (theo quy trình lựa chọn đối tượng nghiên cứu tại mục 2.1.2) thực hiện bởi các bác sỹ điều trị.
Bước 2: Thu thập mẫu tủy xương
Bênh nhân sau khi đủ tiêu chuẩn để tham gia nghiên cứu, sẽ được lấy tủy xương từ gai chậu trước trên. Mỗi bệnh nhân sẽ được gây mê qua mask thanh quản và gây tê tại chỗ, sau đó phẫu thuật viên sẽ hút khoảng 30-35 ml tủy xương từ gai chậu trước trên và được đựng trong ống chuyên dụng có hòa lẫn Heparin với tỷ lệ (1:1).
Bước 3: Phân lập tế bào gốc trung mô từ tủy xương để thu toàn bộ các tế bào đơn nhân và nuôi cấy.
Khối tế bào đơn nhân được tách ra nhờ phương pháp ly tâm tỷ trọng sử dụng dung dịch Ficoll Hypaque. Theo đó, lớp huyết tương ở phía trên cùng của ống Falcon, lớp hồng cầu có tỷ trọng lớn nhất sẽ lắng xuống dưới đáy, lớp phân cách màu trắng ngay dưới huyết tương sẽ được hút nhẹ nhàng bằng pipet nhựa vô trùng, sản phẩm thu được là khối tế bào đơn nhân sẽ được dùng để nuôi cấy.
Thực hiện tại Phòng Tế bào gốc, Viện nghiên cứu Tế bào gốc và Công nghệ Gen Vinmec bởi các chuyên viên và kỹ thuật viên trong đề tài nghiên cứu.
Bước 4: Đánh giá chất lượng tế bào trong quá trình nuôi cấy
-Đánh giá khả năng tăng sinh
Tế bào sau khi được phân lập sẽ được đưa vào nuôi cấy để đảm bảo đủ số lượng truyền cho bệnh nhân với liều 1x106 TB/kg cân nặng
Để đánh giá chính xác khả năng tăng sinh của BMMSCs thì một phần tế bào được cũng được nuôi cấy riêng rẽ và đánh giá thông qua chỉ số “ Thời gian nhân đôi tế bào” (population doubling time - PDT). Tế bào được nuôi cấy ổn định từ passage 3 (P3) đến passage 7 (P7) với mật độ 5000 tế bào/cm2 trong các chai T25. Lặp lại 3 lần ở mỗi mẫu trong điều kiện nuôi cấy 5% O2 và 37°C. Khi mật độ nuôi cấy đạt 80% độ che phủ thì thu lấy tế bào, xác định tỷ lệ sống chết và đếm số lượng tế bào.
Số lần nhân đôi tế bào = log 10(tổng số tế bào thuhoạch/log 10 số tế bào gieo cấy)
PDT = Thời giannuôi cấySố lần nhân đôi
Tỷ lệ tế bào sống =số lượngtế bào sốngTổng số tế bào x100(%)
- Định danh tế bào gốc trung mô từ tủy xương bằng phương pháp đếm tế bào qua dòng chảy
Tế bào gốc trung mô từ tủy xương sau khi được nuôi cấy sẽ tiến hành định danh MSC tại P3 bằng phương pháp đếm tế bào theo dòng chảy sử dụng máy Navios Flow Cytometer của Beckman Coulter. Tối thiểu 106 tế bào được nhuộm với các kháng thể bao gồm CD73, CD90, CD105 và các kháng thể âm tính (CD34, CD45, CD11b, CD14, CD19, CD79α và HLA-DR (Human MSC Analysis Kit, BD Biosciences). Kết quả định danh MSC với tỷ lệ CD73, CD90, CD 105 lớn hơn 95% và các giá trị của các dấu ấn âm tính nhỏ hơn 2%.
Thực hiện tại phòng QC, Viện nghiên cứu Tế bào gốc và Công nghệ Gen Vinmec
- Đánh giá khả năng biệt hóa đa dòng thành tế bào sụn, xương và mỡ
Đánh giá khả năng biệt hóa của tế bào tại lần cấy chuyển số 4. Tế bào được nuôi cấy tăng sinh trong đĩa 12 giếng. Bổ sung môi trường biệt hóa của Miltenyi Biotec cho các dòng biệt hóa xương, sụn , mỡ khi mức độ cho phủ bề mặt của đĩa đạt 80%. Theo dõi các mẫu tế bào biệt hóa hàng ngày, nhuộm tế bào theo các khoảng thời gian như sau:
Tế bào xương: Sau 7-10 ngày, sử dụng thuốc nhuộm Alizarin Red S gắn kết chọn lọc với canxium phosphate của thành phần nên tạo ra từ các tế bào xương được biệt hóa
Tế bào sụn: sau 15- 20 ngày, sử dụng thuốc nhuộm Acian blue 8GX nhạy cảm với proteoglycan và glycosaminoglycan sulface trong mẫu mô sụn tạo thành
Tế bào mỡ: sau khoảng 10 - 13 ngày, sử dụng thuốc nhuộm Oil red O có thể hòa màng thẩm thấu vào bên trong các không bào có chứa các giọt mỡ đã được biệt hóa.
- Đánh giá mức độ bất thường nhiễm sắc thể bằng việc xây dựng nhiễm sắc thể đồ (Karyotyping).
Để phân tích bộ nhiễm sắc thể cho bệnh nhân, ít nhất 2x106 tế bào BM-MSCs được ủ với Colcemid (Karyomax) nhằm giữ các tế bào ở nguyên trạng thái đang phân bào, tế bào sau đó được thu thập bằng cách sử dụng enzyme phân tách, sau đó li tâm thu cặn tế bào. Cố định tế bào bằng dung dịch Carnoy (3 methanol : 1 acetic acid), sau đó được nhuộm nhiễm sắc thể D-Band và lập công thức NST. NST sau khi