2.2.1. Thiết kế nghiên cứu
- Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng, nhãn mở, đơn nhóm, so sánh trước và sau điều trị.
2.2.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Địa điểm: Viện nghiên cứu Tế bào gốc và Công nghệ Gen Vinmec
- Thời gian: Từ tháng 11/2017 đến tháng 03/2020
Hình 2.1. Sơ đồ nghiên cứu
Bước 1: Thu tuyển bệnh nhân (theo quy trình lựa chọn đối tượng nghiên cứu tại mục 2.1.2) thực hiện bởi các bác sỹ điều trị.
Bước 2: Thu thập mẫu tủy xương
Bênh nhân sau khi đủ tiêu chuẩn để tham gia nghiên cứu, sẽ được lấy tủy xương từ gai chậu trước trên. Mỗi bệnh nhân sẽ được gây mê qua mask thanh quản và gây tê tại chỗ, sau đó phẫu thuật viên sẽ hút khoảng 30-35 ml tủy xương từ gai chậu trước trên và được đựng trong ống chuyên dụng có hòa lẫn Heparin với tỷ lệ (1:1).
Bước 3: Phân lập tế bào gốc trung mô từ tủy xương để thu toàn bộ các tế bào đơn nhân và nuôi cấy.
Khối tế bào đơn nhân được tách ra nhờ phương pháp ly tâm tỷ trọng sử dụng dung dịch Ficoll Hypaque. Theo đó, lớp huyết tương ở phía trên cùng của ống Falcon, lớp hồng cầu có tỷ trọng lớn nhất sẽ lắng xuống dưới đáy, lớp phân cách màu trắng ngay dưới huyết tương sẽ được hút nhẹ nhàng bằng pipet nhựa vô trùng, sản phẩm thu được là khối tế bào đơn nhân sẽ được dùng để nuôi cấy.
Thực hiện tại Phòng Tế bào gốc, Viện nghiên cứu Tế bào gốc và Công nghệ Gen Vinmec bởi các chuyên viên và kỹ thuật viên trong đề tài nghiên cứu.
Bước 4: Đánh giá chất lượng tế bào trong quá trình nuôi cấy
-Đánh giá khả năng tăng sinh
Tế bào sau khi được phân lập sẽ được đưa vào nuôi cấy để đảm bảo đủ số lượng truyền cho bệnh nhân với liều 1x106 TB/kg cân nặng
Để đánh giá chính xác khả năng tăng sinh của BMMSCs thì một phần tế bào được cũng được nuôi cấy riêng rẽ và đánh giá thông qua chỉ số “ Thời gian nhân đôi tế bào” (population doubling time - PDT). Tế bào được nuôi cấy ổn định từ passage 3 (P3) đến passage 7 (P7) với mật độ 5000 tế bào/cm2 trong các chai T25. Lặp lại 3 lần ở mỗi mẫu trong điều kiện nuôi cấy 5% O2 và 37°C. Khi mật độ nuôi cấy đạt 80% độ che phủ thì thu lấy tế bào, xác định tỷ lệ sống chết và đếm số lượng tế bào.
Số lần nhân đôi tế bào = log 10(tổng số tế bào thuhoạch/log 10 số tế bào gieo cấy)
PDT = Thời giannuôi cấySố lần nhân đôi
Tỷ lệ tế bào sống =số lượngtế bào sốngTổng số tế bào x100(%)
- Định danh tế bào gốc trung mô từ tủy xương bằng phương pháp đếm tế bào qua dòng chảy
Tế bào gốc trung mô từ tủy xương sau khi được nuôi cấy sẽ tiến hành định danh MSC tại P3 bằng phương pháp đếm tế bào theo dòng chảy sử dụng máy Navios Flow Cytometer của Beckman Coulter. Tối thiểu 106 tế bào được nhuộm với các kháng thể bao gồm CD73, CD90, CD105 và các kháng thể âm tính (CD34, CD45, CD11b, CD14, CD19, CD79α và HLA-DR (Human MSC Analysis Kit, BD Biosciences). Kết quả định danh MSC với tỷ lệ CD73, CD90, CD 105 lớn hơn 95% và các giá trị của các dấu ấn âm tính nhỏ hơn 2%.
Thực hiện tại phòng QC, Viện nghiên cứu Tế bào gốc và Công nghệ Gen Vinmec
- Đánh giá khả năng biệt hóa đa dòng thành tế bào sụn, xương và mỡ
Đánh giá khả năng biệt hóa của tế bào tại lần cấy chuyển số 4. Tế bào được nuôi cấy tăng sinh trong đĩa 12 giếng. Bổ sung môi trường biệt hóa của Miltenyi Biotec cho các dòng biệt hóa xương, sụn , mỡ khi mức độ cho phủ bề mặt của đĩa đạt 80%. Theo dõi các mẫu tế bào biệt hóa hàng ngày, nhuộm tế bào theo các khoảng thời gian như sau:
Tế bào xương: Sau 7-10 ngày, sử dụng thuốc nhuộm Alizarin Red S gắn kết chọn lọc với canxium phosphate của thành phần nên tạo ra từ các tế bào xương được biệt hóa
Tế bào sụn: sau 15- 20 ngày, sử dụng thuốc nhuộm Acian blue 8GX nhạy cảm với proteoglycan và glycosaminoglycan sulface trong mẫu mô sụn tạo thành
Tế bào mỡ: sau khoảng 10 - 13 ngày, sử dụng thuốc nhuộm Oil red O có thể hòa màng thẩm thấu vào bên trong các không bào có chứa các giọt mỡ đã được biệt hóa.
- Đánh giá mức độ bất thường nhiễm sắc thể bằng việc xây dựng nhiễm sắc thể đồ (Karyotyping).
Để phân tích bộ nhiễm sắc thể cho bệnh nhân, ít nhất 2x106 tế bào BM-MSCs được ủ với Colcemid (Karyomax) nhằm giữ các tế bào ở nguyên trạng thái đang phân bào, tế bào sau đó được thu thập bằng cách sử dụng enzyme phân tách, sau đó li tâm thu cặn tế bào. Cố định tế bào bằng dung dịch Carnoy (3 methanol : 1 acetic acid), sau đó được nhuộm nhiễm sắc thể D-Band và lập công thức NST. NST sau khi xử lý với các phương pháp khác nhau như dùng trypsin, dung dịch kiềm, nhiệt độ cao, muối thì vùng dị nhiễm sắc và nhiễm sắc thực sẽ bắt màu khác nhau (vùng dị nhiễm sắc bắt màu đậm, vùng nhiễm sắc thực bắt màu nhạt) tạo nên các vùng băng (band) sáng, tối đặc trưng cho từng NST. Dựa vào hình thái, kích thước và vùng băng đặc hiệu của nhiễm sắc thể, lập công thức NST theo khuyến cáo của Hệ thống di truyền tế bào học người (International System for Human Cytogenetic Nomenclature - ISCN) để phát hiện bất thường số lượng, cấu trúc NST.
Thực hiện tại phòng Gen, Viện nghiên cứu Tế bào gốc và Công nghệ Gen Vinmec.
Bước 5: Kiểm định tính an toàn của tế bào trước truyền cho bệnh nhân.
Xét nghiệm Mycoplama
Xét nghiệm Mycoplasma được thực hiện bằng Kit MycoAlertTM để phát hiện Mycoplasma có trong mẫu nuôi cấy tế bào, quy trình thực hiện theo khuyến cáo của nhà sản xuất (Lonza, Mỹ). Enzyme tạo ra do quá trình dung giải Mycoplasma sẽ xúc tác cho phản ứng chuyển hóa ADP thành ATP khi có mặt cơ chất thích hợp. Sau đó nhờ enzyme luciferase ATP được chuyển thành tín hiệu ánh sáng. Bằng cách đo mức độ ATP trước và sau khi bổ sung cơ chất thích hợp sẽ cho phép phát hiện có hay không sự có mặt của Mycoplasma.). Sử dụng Kit MycoAlertTM cho phép xác định độ phát quang sinh học của mẫu tế bào trước (giá trị A) và sau (giá trị B) khi thêm cơ chất phản ứng để suy ra giá trị X = B/A. Sử dụng ngưỡng [0,9 – 1,2] để nhận định kết quả, với X < 0,9 → Âm tính, với 0,9 < X < 1,2 → Nghi ngờ và X > 1,2 → Dương tính.
Thực hiện tại phòng QC, Viện nghiên cứu Tế bào gốc và Công nghệ Gen Vinmec
Xét nghiệm nội độc tố Endotoxin
Dựa vào phản ứng tạo màu của Limulus Amebocyte Lysate (LAL) và phương pháp đo quang phổ để xác định nồng độ nội độc tố- endotoxin có trong mẫu. Sử
dụng kit phát hiện nội độc tố trên hệ thống máy kiểm tra nội độc tố của hãng Charlie River (Endosafe- PTS 100). Quy trình thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất kit. Giá trị đo được của mẫu là chỉ số EU (endotoxin unit) trong mẫu đã nhân với độ pha loãng. Hàm lượng nội độc tố trong sản phẩm tế bào không được lớn hơn 5 EU/kg cân nặng khi truyền qua đường tĩnh mạch ngoại vi và động mạch tụy. Thực hiện tại phòng QC, Viện nghiên cứu Tế bào gốc và Công nghệ Gen Vinmec.
Xét nghiệm cấy khuẩn cấy nấm
Các mẫu cấy khuẩn, cấy nấm được chuyển tới Khoa xét nghiệm, bệnh viện Đa khoa quốc tế Vinmec để tiến hành và trả kết quả sau từ 3 đến 5 ngày.
Tóm lại, các sản phẩm tế bào gốc trung mô từ tủy xương của các bệnh nhân đái tháo đường típ 2 trước khi truyền phải đảm bảo các tiêu chuẩn:
- Đạt đủ liều truyền 1x106 tế bào/kg cân nặng với thể tích truyền là 20 ml với đường truyền là tĩnh mạch ngoại vi và 10 ml khi truyền vào động mạch tụy.
- Tỉ lệ tế bào sống trên 70% (đánh giá bằng phương pháp nhuộm Trypan Blue).
- Không nhiễm vi khuẩn, vi nấm, và mycoplasma.
- Có đánh giá các biểu hiện bề mặt đạt tiêu chuẩn của tổ chức ISCT.
- Có nồng độ nội độc tố nằm trong giới hạn cho phép truyền cho bệnh nhân (hàm lượng nội độc tố không được lớn hơn 5 EU/kg cân nặng).
- Đảm bảo sự ổn định về số lượng và cấu trúc nhiễm sắc thể theo khuyến cáo của ISCN
Bước 6: Truyền tế bào cho bệnh nhân.
Tế bào truyền cho bệnh nhân theo 2 đường là tĩnh mạch ngoại vi và động mạch tụy. Đường truyền tĩnh mạch ngoại vi xuất phát từ tĩnh mạch cánh tay. Đường truyền động mạch tụy xuất phát từ động mạch đùi.
Các bệnh nhân sau ghép ổn định được xuất viện sau 72 giờ theo dõi, tái khám định kì tại thời điểm 1 tháng, 3 tháng và 6 tháng sau ghép và được đánh giá các chỉ số lâm sàng và cận lâm sàng (FPG và HbA1C).
2.2.4. Chỉ số nghiên cứu
2.2.4.1.Thông tin bệnh nhân:
- Tuổi (năm)
- Giới (nam/nữ)
- BMI =(chiều cao)Cânnặng2 (trong đó: câng nặng: kg, chiều cao: m)
- Thời gian mắc bệnh (năm)
- Tiền sử mắc các bệnh kèm theo (có/ không)
- Chỉ số Glucoso tĩnh mạch lúc đói trước ghép (FPG-mmol/L) và HbA1C (%)
2.2.4.2.Quá trình thu thập tủy xương
- Hiệu suất thu thập (%) = Tế bào đơn nhântrước phân lậpTế bào đơnnhân sau phân lập x100 (%)
- Số lượng tế bào đơn nhân (Mononuclear cell) (tế bào)
2.2.4.3.Quá trình nuôi cấy tế bào truyền cho bệnh nhân
- Tổng số lượng tế bào thu được cho mỗi bệnh nhân (tế bào)
- Số ngày nuôi cấy (ngày)
- Thời điểm truyền theo giai đoạn cấy chuyển.
- Tỷ lệ tế bào sống (%)
2.2.4.4.Đánh giá các đặc điểm của tế bào gốc trung mô từ tủy xương của các bệnh nhân Đái tháo đường TÍP 2
- Thời gian nhân đôi tế bào (giờ)
- Mức độ biểu hiện các dấu ấn bề mặt CD73, CD90, CD105 và các dấu ấn âm tính (%).
- Khả năng biệt hóa của tế bào trung mô ở các bệnh nhân đái tháo đường TÍP 2 (có/không)
- Tính ổn định của nhiễm sắc thể đồ (ổn định/không ổn định).
2.2.4.5.Chỉ số đánh giá tính an toàn của mẫu
- Mycoplama (âm tính/ nghi ngờ/ dương tính)
- Các triệu chúng lâm sang (cơ năng, thực thể).
- Các chỉ số lâm sàng cơ bản (công thức máu, chức năng gan, chức năng thận, đông máu cơ bản, siêm âm tim, siêu âm ổ bụng, X-quang tim-phổi).
- Các chỉ số lâm sàng khác với các bệnh nhân xuất hiện các biến cố bất lợi trong suốt thời gian ghép.
2.2.4.6.Đánh giá tính hiệu quả sau ghép
- Nồng độ đường huyết tĩnh mạch lúc đói (mmol/L): Được đo vào thời điểm buổi sáng khi bệnh nhân đến khám, yêu cầu bệnh nhân nhịn ăn trước 8 giờ khi làm xét nghiệm.
- Nồng độ HbA1C (%): Nồng độ HbA1C được đặc trưng bởi khả năng gắn Glucose lên Hemoglobin của hồng cầu, bình thường chỉ số phần trăm này 4-6%. Các trị số ngoài khoảng này đều cho phép đánh giá khả năng kiểm soát đường huyết của bệnh nhân.
Hai nồng độ này được theo dõi tại thời điểm 72 giờ, 1 tháng, 3 tháng, 6 tháng sau ghép.
Tất cả các chỉ số cận lâm sàng đều được thực hiện tại Khoa xét nghiệm của Bệnh viện đa khoa quốc tế Vinmec.
2.2.4.7.Đánh giá tính an toàn của liệu pháp
- Tác dụng phụ trước ghép, trong ghép và sau ghép
2.2.5. Thiết bị, hóa chất, vật tư tiêu hao
2.2.5.1.Hóa chất
Bảng 2.3. Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên hóa chất Hãng sản xuất Quốcgia
1 Môi trường nuôi cấy MSCs StemCELL Canada
2 Môi trường biệt hóa BiologicalIndustries Israel
3 Trypan Blue solution 4% Thermo Fisher Mỹ
4 CTS™ Fibronectin™ Substrate Thermo Fisher Mỹ
5 CTS™ GlutaMAX™-I Supplement (10X) Thermo Fisher Mỹ
7 CTS™ TrypLE™ Select Enzyme (1X) Thermo Fisher Mỹ
8 KaryoMAX® Colcemid™ Solution in PBS Thermo Fisher Mỹ
9 Methanol Sigma-Sldrich Đức
10 Acetic acid 100% Sigma-Sldrich Đức
11 FBS Sigma-Sldrich Đức
12 Kit định danh human MSCs BD Biosciences Mỹ
13 Mycoplasma Abcam Anh
14 Endotoxin Lozan Mỹ
15 Cồn 70̊ Việt
Nam
2.2.5.2.Thiết bị
Bảng 2.4. Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên dụng cụ Hãng sản xuất Quốc gia
1 Aspiration Integra Canada
2 Kính hiển vi soi ngược có camera Olumpus Mỹ
3 Máy ly tâm Eppendorf Đức
4 Pipet acid Eppendorf Đức
5 Pipet đơn kênh Eppendorf Đức
6 Tủ an toàn sinh học cấp 2 Thermo Fisher Mỹ
7 Tủ nuôi cấy tế bào Thermo Fisher Mỹ
8 Gallios Flow Cytometer BeckmanCoulter Mỹ
2.2.5.3.Vật tư tiêu hao
Bảng 2.5. Vật tư tiêu hao sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên vật tư Hãng sản xuất Quốc gia
1 Chai nuôi cấy Nunc T75 Thermo Fisher Mỹ
2 Chai nuôi cấy Nunc T25 Thermo Fisher Mỹ
3 Đĩa nuôi cấy tế bào 24 giếng Thermo Fisher Mỹ
4 Serological pipette 5 ml Thermo Fisher Mỹ
7 Buồng đếm tế bào Incyto Hàn
8 Ống ly tâm 15 ml Corning Mỹ
9 Ống ly tâm 50 ml Corning Mỹ
10 Đầu Tips Pippette 10 µl Greiner bio-one Áo 11 Đầu Tips Pippette 100 - 200 µl Thermo Fisher Mỹ 12 Đầu Tips Pippette 1000 µl Thermo Fisher Mỹ
13 Gạc sạch Việt Nam
14 Gạc vô khuẩn Việt Nam
15 Gẵng tay phẫu thuật Indonesia
2.2.6. Đạo đức trong nghiên cứu.
Nghiên cứu: “Thử nghiệm lâm sàng nhãn mở đơn nhóm đánh giá tính an toàn và hiệu quả của liệu pháp ứng dụng tế bào gốc trung mô tự thân từ tủy xương trong điều trị đái tháo đường típ 2” đã được thông qua bởi Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu y sinh học cấp quốc gia theo quyết định số 5393/QD BYT ngày 30/11/2017 do Bộ trưởng Bộ Y tế phê duyệt.
2.2.7. Phân tích dữ liệu
- Kết quả nghiên cứu được phân tích trên phần mềm Stata 12.0 và GraphPad Prism 7.04. Các biến số định lượng có hàm phân chuẩn được biểu diễn dưới dạng Mean ± SD và các biến số định lượng không có hàm phân phối chuẩn được biểu diễn dưới dạng Median (range).
- Sử dụng kiểm định t-test ghép cặp (hàm phân phối chuẩn) / Wilcoxon test (hàm phân phối không chuẩn) để đánh giá hiệu quả trước sau.
- Sử dụng kiểm định Mann-whitney test (hàm phân phối không chuẩn cho 2 nhóm độc lập)/ Kruskal-Wallis (hàm phân phối không chuẩn trên 2 nhóm) đối với biến định lượng.
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - BÀN LUẬN
3.1.ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA BÊNH NHÂN THAM GIA NGHIÊN CỨU
Phân tích kết quả trên 22 bệnh nhân đã hoàn thành thời gian theo dõi 6 tháng tại thời điểm báo cáo nghiên cứu. Kết quả điều trị của các bệnh nhân được trình bày theo 2 đường truyền là tĩnh mạch (TM) và động mạch (ĐM).
Bảng 3.6. Đặc điểm chung của bệnh nhân tham gia nghiên cứu. Tất cả bệnh nhân
(N=22) Tuổi, Mean±SD, năm 57,32 ± 10,2
>50 tuổi 3 (13,6) <50 tuổi 19 (86,6) Giới,N(%) Nam 14 (63,6) Nữ 8 (35,4) BMI, Mean±SD 23,0 ± 2,7 Thời gian mắc bệnh 11,3 (2-25) Tiến sử sử dụng thuốc lá, n (%) Không 22 (100) Có 0 (0)
Tiền sử dụng rượu bia, n (%)
Không 21 (95,5)
Có 1 (4,5)
Tiền sử tăng huyết áp, n (%)
Không 15 (68,2)
Có 7 (32,8)
Tiền sử rối loạn lipid máu, n (%)
Không 3 (13,6)
Có 19 (86,4)
Chỉ số cận lâm sàng trước ghép, n (%)
Nộng độ đường huyết TM lúc đói (mmol/L) 7,9 ± 1,9
HbA1C (%) 8.,4 ± 0,6
Đánh giá đặc điểm bệnh nhân tham gia nghiên cứu trên cả 2 nhóm TM và ĐM cho thấy: Phần lớn bệnh nhân tham gia nghiên cứu là nam giới với tỷ lệ là 63,6%.
Độ tuổi trung bình là 57,3 ± 10,3 (n=22) tuổi. Tuy nhiên, phần lớn các bệnh nhân tham gia nghiên cứu đều đạt độ tuổi trên 50 tuổi, chỉ có 3 bệnh nhân dưới 50 tuổi. Độ tuổi phân bố không đều theo tiêu chí của đề tài đã chọn cũng có thể ảnh hưởng việc đánh hiệu quả điều trị theo tiêu chí này bởi một đặc điểm quan trong
của việc tăng sinh tế bào gốc trung mô liên quan mật thiết đến tuổi của bệnh nhân [2]. Theo thời gian số lượng tế bào gốc ở mỗi cá thể có nguy cơ giảm dần và việc nuôi cấy chúng ngày càng trở lên khó khăn. Thậm chí ở một số nghiên cứu có những mẫu tế bào gốc của một số bệnh nhân tiểu đường không thể tăng sinh được