3.2.2.1.Hình thái tế bào gốc trung mô từ tủy xương
Trong khi nuôi cấy bằng môi trường không chứa huyết thanh (Serum-free) và không chứa các chất có nguồn gốc từ động vật (Xeno-free), dòng tế bào gốc trung mô phân lập từ tủy xương của các bệnh nhân mắc ĐTĐ T2 có biểu hiện các đặc điểm hình thái học cơ bản của tế bào gốc bao gồm: khả năng bám dính trên bề mặt chai nuôi cấy bằng nhựa, có hình dạng giống nguyên bào sợi, tế bào thuôn dài, nhân to, dễ quan sát. Hình thái của tế bào không thay đổi trong suốt thời gian nuôi cấy khi quan sát từ lần cấy chuyển thứ 3 (P3) đến lần cấy chuyển thứ 7 (P7) và tương tự nhau ở các mẫu (Hình 3.1).
Hình 3.1. Đặc điểm hình thái học của tế bào gốc trung mô từ tủy xương của bệnh nhân đái tháo đường típ 2 khi nuôi cấy trong môi trường không chứa huyết thanh (Serum-free) và không chứa các chất từ động vật (xeno-free). Hình đại diện
của dòng tế bào gốc BM-MSCs được nuôi cấy ở P3 và P7 cho thấy sự đồng nhất về hình thái khi nuôi cấy trong môi trường phòng thí nghiệm. Thanh tỉ lệ: 100 µm
3.2.2.2.Thời gian tăng sinh tế bào gốc trung mô từ tủy xương của bệnh nhân đái tháo đường típ 2
Khả năng tăng sinh của tế bào gốc trung mô từ tủy xương của các bệnh nhân ĐTĐ T2 được đánh giá thông qua chỉ số “Thời gian nhân đôi” (Population Doubling Time - PDT). Phân tích PDT của tế bào trên 16 bệnh nhân ở cả hai nhóm cho thấy giá trị trung vị của thời gian nhân đôi là 59,29 giờ. Tuy nhiên, khi phân tích khả năng tăng sinh của tế bào theo số năm mắc ĐTĐ T2 cho thấy có sự khác biệt về thời gian nhân đôi của tế bào gốc trung mô từ tủy xương của các nhóm bệnh nhân. Thời gian nhân đối tế bào của nhóm có thời gian mắc từ 5-15 năm là cao nhất với trung vị là 81,76 (61,52- 100,36). Có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở nhóm có thời gian mắc nhỏ hơn 5 năm và nhóm bệnh nhân có thời gian mắc dưới 5 năm với khi sử dụng kiểm định Kruskal Wallis test (p < 0,05) (Hình 3.2).
Hình 3.2. Thời gian nhân đôi của tế bào gốc trung mô từ tủy xương ở bệnh nhân đái tháo đường típ 2.
Thời gian tăng sinh tế bào gốc trung mô từ tủy xương của các bệnh nhân mắc ĐTĐ T2 theo số năm mắc (G1: Thời gian mắc <5 năm,n= 5, G2: Thời gian mắc bệnh 5-15 nămn,n= 9 G3: Thời gian mắc bệnh >15 năm, n=5) Thời gian nhân đối tế bào của
nhóm có thời gian mắc từ 5-15 năm là cao nhất với trung vị là 81,76 (61,52- 100,36). Có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở nhóm có thời gian mắc nhỏ hơn 5 năm và nhóm bệnh nhân có thời gian mắc dưới 5 năm với khi sử dụng kiểm định
Kruskal Wallis test (p < 0,05).
Những bệnh nhân mắc trên 5 năm thì nguy cơ biến chứng của tiểu đường tăng cao, điều này gợi ý rằng, việc xuất hiện các biến chứng sau mắc sẽ ảnh hưởng đến chất lượng tế bào gốc của các bệnh nhân mắc ĐTĐ T2 mà nguyên nhân sâu xa có thể do ảnh hưởng từ môi trường tiểu đường trong cơ thể ở các bệnh nhân này. Một số nghiên cứu về ảnh hưởng của tiểu đường lên tốc độ tăng sinh cho thấy thời gian mắc bệnh càng lâu thì tốc độ tăng sinh tế bào có xu hướng giảm [62]. Các bệnh nhân có thời gian mắc dưới 5 năm có PDT là 57,81 giờ (42,47- 59,09, n=5) điều này được giải thích bởi các bệnh nhân này có tuổi khá trẻ, 2/5 bệnh nhân thuộc nhóm này có tuổi dưới 50 chiếm toàn bộ số lượng bệnh nhân trẻ của đối tượng tham gia nghiên cứu. Tuy nhiên vẫn có 2/5 bệnh nhân trên 50 tuổi nên không thể khẳng hoàn toàn rằng yếu tố tuổi quyết định đến thời gian tăng sinh tế bào mà cần có kết hợp với diễn biến bệnh. Đây cũng là một trong những điều đáng lưu ý từ tế bào của các bệnh nhân ĐTĐ T2. Tuổi cao kèm theo bệnh lý mạn tính với thời gian mắc bệnh kéo dài có thể ảnh hưởng đến các đặc tính của tế bào gốc. So sánh với PDT của các dòng tế bào gốc trung mô khác nhau trong nghiên cứu của June và cộng sự, 2016, cho thấy rằng các dòng tế bào khỏe mạnh trong nghiên cứu của họ có thời gian cao hơn với nghiên cứu của chúng tôi là 52 giờ, tuy nhiên nhóm bệnh nhân có thời gian mắc dưới 5 năm thì có PDT tương đương và nhóm có thời gian mắc từ 5 đến 15 năm lại có PDT cao hơn. Trong khi đó, PDT của tế bào gốc tử dây rốn, nhau thai , mô mỡ lại thấp hơn với giá trị tương ứng là 43, 37, 40 giờ [98]. Một nghiên cứu khác của của Michalina Alika và cộng sự (năm 2019) nghiên cứu các đặc điểm tăng sinh của tế bào gốc trung mô từ mô mỡ cũng cho thấy thời gian nhân đôi tế bào của nhóm bệnh nhân tiểu đường là 47 giờ tương đồng với nhóm có thời gian mắc <5
năm của chúng tôi [4]. Từ đó rút ra giả thiết rằng thời gian nhân đối của tế bào gốc có liên quan đến số năm mắc bệnh ĐTĐ T2 và diễn biến theo thời gian của các bệnh nhân ĐTĐ T2.
Các nghiên cứu về ảnh hưởng của môi trường tiểu đường lên đặc điểm tăng sinh của tế bào gốc trung mô đã được thực hiện trên các loại tế bào khác nhau. Trong nghiên cứu của Phadnis và công sự, 2009, trên 90 bệnh nhân mắc ĐTĐ T2 cho thấy chỉ có 57% số tế bào của bệnh nhân có thể tăng sinh được, với nhiều mẫu tế bào của các bệnh nhân trên 50 tuổi không thể tăng sinh và các bệnh nhân trẻ có thể tăng sinh lên đến lần cấy chuyển thứ 15 [90]. Tuy nhiên, trong nghiên cứu của chúng tôi hầu hết các mẫu tế bào của bệnh nhân trên 50 tuổi đều tăng sinh ổn định, ngoài ra tế bào của các bệnh nhân trẻ tuổi cho thấy khả năng tăng sinh vượt trội hơn tương đồng với kết quả nghiên cứu trên dòng tế bào gốc thương mại cho thấy khả năng tăng sinh đến lần cấy chuyển thứ 23 và sau đó chúng dường như bước vào giai đoạn lão hóa [120]. Đánh giá ảnh hưởng của môi trường bệnh tiểu đường lên tế bào gốc mô mỡ trong nghiên cứu của Michalina Alika và cộng sự không chỉ dừng lại ở việc tính toán thời gian nhân đôi của tế bào mà nghiên cứu còn chỉ ra mức độ biểu hiện của protein Ki-67- một protein hạt nhân có vai trò quan trọng trong sự tăng sinh tế bào và được biểu hiện trong giai đoạn chu kỳ tế bào G1,S,G2,M và không có trong pha G0 bằng phương pháp nhuộm miễn dịch huỳnh quang. Điểm phần trăm Ki-67 được tính là số ô vuông có bắt màu dương tính, trong khi ở nhóm chứng điểm phần trăm này là 60% thì ở nhóm bệnh nhân tiểu đường là 40%. Hơn nữa, các nghiên cứu trước đã chứng minh rằng hoạt động tăng sinh giảm có liên quan mật thiết đến việc rút ngắn thời gian telomere ở những bệnh nhân mắc các bệnh liên quan đến tuổi và bệnh ĐTĐ T2 [28] [97].
3.2.2.3.Đánh giá biểu hiện các dấu ấn bề mặt của tế bào gốc trung mô từ tủy xương của bệnh nhân đái tháo đường típ 2
Định danh tế bào gốc theo phương pháp đếm tế bào qua dòng chảy cho thấy tất cả các mẫu tế bào đều cho biểu hiện các dấu ấn dương tính CD73, CD90, CD105 trên 95% và biểu hiện rất ít các dấu ấn âm tính bao gồm CD34, CD45, CD11b, CD14, CD19, CD79α và HLA-DR (<2%) theo tiêu chuẩn của Hiệp hội Quốc tế về Liệu pháp tế bào ISCT 2006 (International Society for Cell and Gene Therapy 2006) cả P3 và P7 (Hình 3.3) cho thấy khi các bệnh nhân truyền ở các giai đoạn cao hơn thì các tế
bào này vẫn đảm bảo được các đặc trưng của tế bào gốc. Việc các bệnh nhân truyền tế bào tại P5 thì theo tiêu chuẩn này vẫn đảm bảo về chất lượng tế bào. Tuy nhiên, một thực tế là tiêu chuẩn của ISCT trong việc xác định kiểu hình của MSC thì với các dấu ấn bề mặt này vẫn chưa thể phân biệt được MSC với các nguyên bào sợi, hay một số dòng tế bào khác. Điều này được thể hiện ở việc các MSC được nuôi cấy có tính đồng nhất và mạnh mẽ đối với CD105, CD90 và CD73, bất kể trong thời gian nuôi cấy lâu dài. Tuy nhiên, CD105 và CD73 cũng được thể hiện trên các nguyên bào sợi da – một loại tế bào có khả năng tăng sinh và biệt hóa thấp hơn nhiều so với BM-MSC. Hơn nữa, một loại tế bào có khả năng bám dính tương tự MSC có khả năng nhân lên trong tế bào nội mô tĩnh mạch, tế bào tĩnh mạch chủ cũng là biểu hiện CD105 và CD73 dương tính. Điều này ngụ ý rằng việc chứng minh duy nhất biểu hiện CD105 và CD73 và CD90 trên các tế bào nuôi cấy là không đủ để chứng minh danh tính MSC của chúng. Sẽ là thuận lợi nếu có thể tìm thấy một dấu phân tử của các MSC, theo cách của oct-4 cho các tế bào gốc phôi nhằm giúp xác định các MSC trong các mô và cơ quan khác. Một số gợi ý rằng việc sử dụng Stro-1 kết hợp với CD106 trong hệ thống dấu ấn dương tính nhằm tăng khả năng lựa chọn tối ưu dòng MSC, tuy nhiên các dấu ấn này lại lại biểu hiện tốt trong các tế bào MSC gốc mà giảm biểu hiện ở các dòng MSC đã tăng sinh và biệt hóa thành các dòng khác [43]. Ngoài ra, sự biểu hiện đồng thời của các yếu tố phiên mã (TF) kích hoạt một số dòng trung mô (bao gồm mỡ, sụn xương và các dòng tế bào khác) đã được báo cáo trong các BM-MSCs gốc hoặc thế hệ các dòng tế bào được tăng sinh từ chúng . Gần đây, một số nghiên cứu đã tìm thấy sự biểu hiện mạnh mẽ của các gen hỗ trợ pericytic và hematopoiesis trong CD271 + của BM MSC gốc hay đã tăng sinh với các phát hiện trước đó thu được bằng cách sử dụng lựa chọn MSC dựa trên Stro-1 [17]. Tuy nhiên, tất cả các giả thiết này vẫn chưa đủ mạnh để có thể đưa ra được các căn cứ về việc tìm ra các dấu ấn đặc trung hơn cho các dòng MSC nói chung và BM-MSC nói riêng.
Lần cấy chuyển (n=22) Dấu ấn bề mặt P3 P7 CD73 (%) Mean,SD 98,8 ± 0,5 97,8 ± 0,9 CD90 (%) Mean, SD 98,6 ± 1,2 98,9 ± 1,2 CD105 (%) Mean, SD 98,5 ± 1,2 99,6 ± 0,7 CD45, CD34, CD11b, CD19, HLA-DR (%) 0,005 0,077
Hình 3.3. Đánh giá biểu hiện dấu ấn bề mặt tế bào gốc trung mô từ tủy xương của bệnh nhân mắc đái tháo đường típ 2 tại thời điểm cấy chuyển số 3 và số 7 bằng
phương pháp đếm tế bào theo dòng chảy.
A - Hình ảnh biểu hiện các dấu ấn tế bào tại P3 của bệnh nhân nam, 57 tuổi với mức độ biểu hiện các dấu ấn dương tính với CD 73 là 96,9%, CD90 là 99,5%, CD105 là 99,5% và các dấu ấn âm tính(CD45, CD34, CD11b, CD19, HLA-DR) là 0,077%.
3.2.2.4.Đánh giá khả năng biệt hóa của tế bào gốc trung mô từ tủy xương của bệnh nhân đái tháo đường típ 2
Đánh giá khả năng biệt hóa tế bào của tất cả các mẫu bệnh nhân cho thấy tất cả các mẫu tế bào BM-MSC của các bệnh nhân ĐTĐ T2 đều có khả năng biệt hóa thành các tế bào mỡ, xương và sụn. Nhuộm các tế bào mỡ với thuốc nhuộm Oil red O sẽ thấy rõ các không bào chứa các giọt lipid bắt màu vàng cam do thuốc nhuộm này có khả năng thẩm thấu qua màng phospholipid kép của tế bào, sau đó đi vào không bào và giúp các giọt lipid bắt màu một cách rõ ràng (Hình 3.4A). Các tế bào sau khi được biệt hóa thành xương thể
hiện màu đỏ khi nhuộm với thuốc nhuộm Alizarin Red S bởi sự gắn kết chọn lọc với canxium phosphate của thành phần nên tạo ra từ các tế bào xương được biệt hóa (Hình 3.4B). Các tế bào sụn được nhuộm bởi Acian blue 8GX
chất nhuộm đặc hiệu của proteoglycan và glycosaminoglycan trên bề mặt tế bào trong mẫu mô sụn tạo thành (Hình 3.4C).
Khả năng biệt hóa thành tế bào xương và mỡ cho thấy sự ổn định hơn tế bào sụn. Có sự khác biệt về mức độ biệt hóa giữa các mẫu bệnh nhân tuy nhiên chúng tôi vẫn chưa có đủ công cụ để có thể định lượng sự khác biệt này. Đánh giá khả năng biệt hóa theo tiêu chuẩn của ISCT 2006 mang tính chất định tính cho các mẫu tế bào để xác định rằng quần thể tế bào gốc còn khả năng biệt hóa hay không sau khi nhuộm với các thuốc nhuộm đặc hiệu, tuy nhiên lại không thể đánh giá sự khác biệt của các nhóm bệnh nhân [29]. Khi nghiên cứu về khả năng biệt hóa của nhóm tế bào gốc trong liệu pháp tế bào để điều ĐTĐ T2 nghiên cứu của Phadnis và cộng sự cho thấy môi trường tiểu đường không ảnh hưởng nhiều đến khả năng biệt hóa của tế bào gốc trung mô từ tủy xương, tuy nhiên nghiên cứu này cũng không làm rõ được mức độ biệt hóa để so sánh giữa các nhóm [90]. Một nghiên cứu khác của nhóm tác giả về việc so sánh khả năng biệt hóa của các dòng tế bào khác nhau: tủy xương, mô mỡ, dây rốn và nguyên bào sợi của tế bào gốc trung mô từ mô mỡ cho kết quả các gen biểu hiện sau khi biệt hóa tạo xương (DLX5 RUNX2, SPP1), tạo mỡ (PPARG, C / EBPA và LPL) và các gen liên quan đến tạo sụn (BMP7, SOX9 và COL2A1) đã được thử nghiệm [123] [54]. Việc sự dụng mức độ biểu hiện gen là cần thiết đề đánh giá sự biệt hóa khác nhau giữa các bệnh nhân, từ đó đánh giá được mức độ biệt hóa tối ưu có thể áp dụng trong điều trị cá thể định hướng các phương pháp điều trị hiệu quả hơn.
Hình 3.4. Khả năng biệt hóa đa dòng của tế bào gốc trung mô từ tủy xương của bệnh nhân đái tháo đường típ 2 - nam, 37 tuổi tại giai đoạn cấy chuyển số 3 thành tế bào mỡ, xương và sụn . A - Tế bào trước biệt hóa, B - Tế bào mỡ sau khi nhuộn với thuốc nhuộm Oil red O xuất hiện các giọt lipid bắt màu vàng cam (vị trí mũi
tên chỉ), C-Tế bào xương sau khi nhuộm với Alizarin Red S bắt màu đỏ, D - Tế bào sụn sau khi nhuộm với thuốc nhuộm Acian blue 8GX bắt màu xanh lam. Thanh tỷ lệ: 50µm.
3.2.2.5.Phân tích bộ nhiễm sắc thể người sau thời gian nuôi cấy của tế bào gốc trung mô từ tủy xương của bệnh nhân đái tháo đường típ 2
Hình 3.5. Hình ảnh bộ nhiễm sắc thể người 46, XY tại giai đoạn cấy chuyển số 3 trên tế bào gốc trung mô từ tủy xương của bệnh nhân đái tháo đường típ 2 - nam,
Đánh giá kết quả phân tích nhiễm sắc thể của 22 mẫu bệnh nhân tại P3, tất cả các mẫu đều cho ra kết quả bình thường hình thái nhiễm sắc thể và đủ tiêu chuẩn để truyền cho bệnh nhân (Hình 3.5). Việc tăng sinh tế bào gốc qua những lần cấy chuyển khác nhau chứa ẩn các nguy cơ thay đổi về số lượng cũng như cấu trúc nhiễm sắc thể. Để kiểm tra được tính an toàn cũng ổn định về mặt nhiễm sắc thể, tất cả các mẫu truyền cho bệnh nhân đều được đánh giá kiểu hình nhiễm sắc thể. Theo khuyến cáo của Hệ thống di truyền tế bào học người (International System for Human Cytogenetic Nomenclature - ISCN) thì việc phân tích một bộ nhiễm sắc thế cần đến 20 tế bào đang trong chu kì phân bào tại pha phân bào (Metaphase) [62]. Tuy nhiên, không phải lúc nào số lượng metaphase cũng đủ cho một lần phân tích. Trong nghiên cứu của chúng tôi việc phân tích bộ nhiễm sắc thể người sau thời gian nuôi cấy tại giai đoạn P3 cho thấy hầu hết các mẫu tế bào bệnh nhân đều cho kết quả bình thường của hình thái nhiễm sắc thể. Rối loạn số lượng không lặp lại xảy ra ở một số mẫu với tỷ lệ thấp điều này được giải thích bởi kỹ thuật phân tích G- banding luôn có các sai số liên quan đến số lượng. Trong một nghiên cứu tổng quan