a. Phương pháp sắc ký ái lực
Khi protein tái tổ hợp đã dễ dàng được biểu hiện ở các vi sinh vật như E. coli
thì yêu cầu đặt ra là cần có phương pháp để tinh sạch các protein tái tổ hợp này. Do đó, protein tái tổ hợp thường được dung hợp với một số đuôi ái lực như: poly- histidine, Glutathione S-transferase (GST), vv…
Một trong những phương pháp tinh sạch sắc ký ái lực phổ biến là IMAC (Immobilized Metal-Affinity Chromatography) được sử dụng để tinh sạch các protein tái tổ hợp có chứa đuôi poly-histidine [38]. IMAC dựa trên sự tương tác giữa các ion kim loại chuyển tiếp (như Co2+, Ni2+, Cu2+, Zn2+) được cố định trên một mạng lưới gel (sepharose) với các chuỗi bên acid amin đặc biệt. Histidine là axit amin có chứa vòng imidazole đóng vai trò là nhóm cho điện tử, nên dễ dàng hình thành liên kết phối hợp với kim loại chuyển tiếp bất động. Vì vậy protein tái tổ hợp chứa chuỗi peptide gồm các histidine liên tiếp sẽ được giữ lại một cách hiệu quả trên mạng lưới gel IMAC. Hơn nữa, chuỗi poly-histidine cũng dễ dàng được
rửa giải bằng cách điều chỉnh pH của dung dịch đệm rửa hoặc bổ sung imidazole tự do như là chất cạnh tranh với histidine [4].
Phương pháp IMAC đã tinh sạch thành công trên các hệ thống vật chủ biểu hiện như E. coli, Saccharomyces cerevisiae, tế bào côn trùng, tế bào động vật với hiệu suất tinh sạch cao lên đến 95%. Tuy nhiên, yêu cầu đối với phương pháp là mức độ biểu hiện của protein tái tổ hợp phải đủ lớn để tạo nên sự đồng nhất. Trong một số trường hợp, quy trình tinh sạch đuôi ái lực poly-histidine có thể được thay đổi để tăng độ tinh sạch như sử dụng hai đuôi ái lực hoặc kết hợp loại bỏ His-tag với các bước tinh sạch IMAC đảo ngược [24].
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng cột tinh sạch Glass-Econo Column (kích thước lỗ màng 30 µm) có chứa các hạt gel gắn nickel (Ni-NTA Agarose, Qiagen). Khi có mặt nickel, các phân tử NTA cố định ion Ni2+ tạo nên mạng lưới ion kim loại có ái lực cao với đuôi 6xHis được gắn vào đầu N- của protein tái tổ hợp.
b. Phương pháp kết tủa ammonium sulfate
Thông thường, có rất ít protein chỉ hòa tan trong nước và hầu hết cần ít nhất một nồng độ muối nhỏ để duy trì nếp gấp và ổn định. Ở trạng thái tự nhiên, protein có khả năng tích điện âm hoặc dương tùy thuộc vào từng vùng. Sự có mặt của muối giúp protein trung hòa điện tích bề mặt, ngăn ngừa sự kết tụ. Tuy nhiên, khi nồng độ muối tăng lên, protein tiếp tục tích điện dẫn đến sự kết tụ. Độ tan của protein tăng khi thêm lượng muối nhỏ hơn 0.15 M. Ngược lại, nếu nồng độ muối cao hơn, protein có xu hướng bị kết tủa. Bên dưới là dãy các ion sắp xếp theo chiều salt-out giảm dần, salt-in tăng dần, với pH của dung dịch > pI của protein; và ngược lại nếu pI của protein < pH của dung dịch [10]:
Anion: PO43- > SO42- > CH3COO- > Cl- > Br- > ClO4- > SCN- Cation: NH4+ > Rb+ > K+ > Na+ > Li+ > Mg2+ > Ca2+ > Ba2+
Ammonium sulfate (AS) là một trong những muối có độ hòa tan cao nhất, độ bão hòa dung dịch là 4.1 M ở 25oC, 4.06 M ở 20oC, 3.97 M ở 10oC, 3.93 M ở 4oC và 3.9 M ở 0oC. Khả năng hòa tan cao giúp chúng phân ly mạnh thành các ion âm và ion dương, dễ dàng trung hòa điện tích cho protein. Vì thế, muối AS được sử dụng trong phương pháp kết tủa mà vẫn duy trì được khả năng cuộn gập tự nhiên của protein. Tùy thuộc vào khối lượng phân tử, cấu trúc không gian của mỗi protein
mà chúng sẽ kết tủa ở nồng độ muối khác nhau. Ở nồng độ muối AS 90% độ bão hòa, tất cả các protein đều bị kết tủa [41]. Protein Pwo DNA polymerase tái tổ hợp trong nghiên cứu theo lý thuyết bao gồm 790aa, có pI tương ứng 7.92 và khối lượng khoảng 92 kDa. Theo một nghiên cứu tương tự, protein Taq DNA polymerase (kích thước ~90 kDa) đã được tinh sạch thành công sử dụng nồng độ muối AS khoảng 50% độ bão hòa trên tổng thể tích dung dịch [32]. Tuy nhiên phương pháp kết tủa này được sử dụng phổ biến hơn khi tinh sạch các protein liên kết màng tế bào.
CHƯƠNG 2 - VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu nghiên cứu
Nghiên cứu được thực hiên tại Phòng thí nghiệm Bộ môn Di truyền học, và PTN Sinh học phân tử tế bào (Molecular Cell Biology Lab) thuộc Trung tâm Khoa học và Sự sống, Khoa Sinh học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – ĐHQGHN.
2.1.1. Nguyên vật liệu
Chủng vi sinh vật sử dụng trong nuôi cấy: dòng tế bào khả biến E. coli BL21 (DE3) được lưu trữ trong bình ni tơ lỏng.
Vector biểu hiện protein tái tổ hợp trong nghiên cứu: plasmid pEtM (biến thể của PET32a) nhận được từ phòng thí nghiệm sinh học cấu trúc I thuộc Bộ môn Sinh học, Khoa khoa học, Đại học Quốc gia Singapore.
Gen mã hóa Pwo-pol và mồi nhân dòng gen được tổng hợp hóa học bởi công ty TNHH MTV Sinh hóa Phù Sa.
2.1.2. Dụng cụ và thiết bị
Thiết bị dùng trong sinh học phân tử: Máy PCR Mastercycler nexus Eppendorf (Đức), Bộ điện di ngang Mupid-one (Japan), bộ điện di đứng BioRad (Đức), hệ thống máy soi gel (Mỹ).
Thiết bị dùng trong nuôi cấy vi sinh vật: Tủ an toàn sinh học, máy lắc nuôi vi khuẩn (Hàn quốc).
Thiết bị dùng trong tinh sạch protein tái tổ hợp: Máy siêu âm LABONIC® M (Đức), Máy ly tâm ống epp 1.5 ml hoặc 2 ml, máy ly tâm ống falcon tốc độ cao Eppendorf, Cột tinh sạch Glass-Econo Column – BioRad (Đức)
2.1.3. Hóa chất và môi trường
Nghiên cứu sử dụng 2 loại môi trường (LB lỏng, LB agar) cho nuôi cấy vi khuẩn và một số dung dịch đệm, hóa chất stock được liệt kê trong bảng 5. Các hóa chất, dung dịch đệm được pha với các nồng độ stock (50X, 10X…) trước khi đem sử dụng làm thành phần cho đệm điện di DNA, điện di protein, tinh sạch protein…
Hóa chất để pha các dung dịch đệm được mua từ các hãng uy tín như Merck, Thermo Scientific, Sigma. Bên cạnh đó, nghiên cứu cũng sử dụng một số bộ kit thương mại như kít tách chiết plasmid (Thermo Scientific), kít tinh sạch/thôi gel sản phẩm PCR và sản phẩm cắt, nối DNA/plasmid (iNtRon).
Bảng 5: Dung dịch đệm, hóa chất pha stock
Loại dung dịch Tên hóa chất Nồng độ Thành phần Khối lượng (thể tích)
Môi trường (1L) LB lỏng Tryptone 10 g
(bảo quản 4oC) NaCl 10 g
Yeast extract 5 g
LB agar LB lỏng 1L
Agar 15 g
Đệm Stock (1L) Tris HCl 1 M Tris base 121.1 g (bảo quản 4oC) pH 6.8 HCl (đặc) 80-85 ml pH 8.0 40-42 ml pH 8.8 32-35 ml EDTA, pH 8.0 0.5 M EDTA 148 g NAOH 30-40g SDS, pH 6.6 10% SDS 100 g APS 10% APS 100 g Acrylamide/Bis 30% Acrylamide 300g Bis-acrylamide 8 g (100 ml) NiCl2 50 mM 1.296 g NaCl 5 M 292.2 g KCl 1 M 74.55 g (NH4)2SO4 1 M 132.14 g MgSO4 1 M 120.37 g BPB 0.2% 0.2 g (-20oC) 100 ml IPTG 1M 238 g Imidazole 1M 6.8 g DTT 1M 154.5 g BSA 100 mg/ml 10 g Ampicilin 100 mg/ml 10 g a. Đệm điện di DNA
Đệm TAE, stock 50X (2 M Tris, 50 mM EDTA) là đệm chạy điên di gel agarose.
Trong 1 lít bao gồm 242 g tris base; 57.1 ml acetic acid (đặc) và 100 ml EDTA 0.5 M, pH 8.0, lưu ý ban đầu chỉ đổ vào khoảng 800ml nước cất để hòa tan các hóa chất trước khi thêm nước cho đủ 1 lít vì các hóa chất có khối lượng lớn cũng chiếm một lượng thể tích nhất định.
DNA loading dye (5X) tra mẫu DNA bao gồm 25% Glycerol, 25 mM EDTA, 0.5%
b. Đệm điện di protein
Đệm Running 1X (25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH8.3) là dung dịch
đệm chạy điên di gel SDS-PAGE. Trong 1 lít running buffer 1X bao gồm 30.3 g tris base, 144 g glycine, 10 g SDS. Tương tự pha đệm TAE, dùng khoảng 800 ml nước cất hòa tan các hóa chất trước khi thêm nước vào để được 1 lít dung dịch.
SDS loading dye (5X) tra mẫu protein bao gồm 250mM Tris, pH 6.8, 10% (g/ml)
SDS, 30% Glycerol, 5% β-mercapitalethanol, 0.02% BPB, sau khi pha hỗn hợp có màu xanh lục đậm, có thể thay đổi tùy thuộc vào pH của dung dịch.
Đệm nhuộm gel SDS-PAGE gồm có 0.1% (g/ml) Coomassie Brilliant Blue G-250
và 50% methanol, 10% acetic acid tổng thể tích dung dịch đệm.
Đệm tẩy gel SDS-PAGE gồm có 40% methanol, 10% acetic acid tổng thể tích dung
dịch đệm.
c. Đệm tinh sạch và xử lý cột tinh sạch
Các dung dịch đệm sử dụng trong quá trình tinh sạch protein bằng cột sắc ký ái lực nickel-resin:
Đệm A1 bao gồm 50mM Tris-HCl, pH 8.0, 300mM NaCl, 5mM Imidazole Đệm B1 bao gồm 50mM Tris-HCl, pH 8.0, 300mM NaCl, 30mM Imidazole Đệm C1 bao gồm 50mM Tris-HCl, pH 8.0, 300mM NaCl, 500mM Imidazole
Đối với phương pháp tinh sạch protein bằng phương pháp kết tủa (NH4)2SO4
sử dụng 2 dung dịch đệm:
Đệm A2 bao gồm 50mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA Đệm B2 bao gồm 50mM Tris HCl, 20% sucrose, 1mM EDTA Đệm C2 bao gồm 50mM Tris HCl, 300mM NaCl
Đệm thẩm tách cho cả hai phương pháp bao gồm các thành phần: 20mM Tris-HCl,
pH 8.0, 200mM NaCl
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1. Thiết kế gen đích mã hóa Pwo DNA polymerase
Chúng tôi sử dụng thông tin trình tự amino acid quy định protein DNA polymerase I của vi khuẩn Pyrococcus woesei đã công bố trên GenBank (AAB67984) để thiết kế gen đích mã hóa Pwo DNA polymerase. Trình tự gen đích được tối ưu biểu hiện phù hợp với vật chủ E. coli sử dụng phần mềm online
“GenSmart Codon Optimization”. Sau đó, trình tự cặp mồi nhân dòng (bảng 6) được thiết kế trực tiếp từ trình tự gen tối ưu:
Bảng 6: Trình tự cặp mồi nhân dòng gen mã hóa Pwo DNA
STT Tên Trình tự (5'-3') Độ dài Tm
1 Pwo-
BamHI GCggatccATTCTGGATGTGGATTATATCAC 31 bp 53.75
2 Pwo-
EcoRI CGgaattcTTAGCTTTTCTTAATGTTCAGC 30 bp 53.07
Thết kế mồi nhân gen Pwo DNA polymerase chứa vị trí cắt enzyme giới hạn
Cặp mồi sử dụng để nhân dòng được thiết kế chính xác ở hai đầu đoạn gen mã hóa Pwo DNA polymerase. Mồi xuôi được xác định nằm ở đầu 5’ trên mạch bổ sung (positive strand – cùng chiều phiên mã với f1 origin) của đoạn gen đích gắn với trình tự cắt giới hạn của enzyme BamHI. Mồi ngược nằm tương ứng ở đầu 5’ trên mạch khuôn (negative strand) của đoạn gen đích gắn với trình tự cắt giới hạn của enzyme EcoRI. Sau đó, trình tự gen và mồi được tổng hợp theo phương pháp hóa học bởi Công ty TNHH MTV Sinh Hóa Phù Sa (PHUSA Biochem). Gen tổng hợp được chèn vào vector PUC19, bảo quản ở -20oC.
2.2.2. Nhân dòng, tạo vector mang gen mã hóa Pwo DNA polymerase
Vector tổng hợp PUC19-Pwo
(Sản phẩm PCR) 5’-ggatcc-Gen Pwo-gaattc-3’
(1) PCR BamHI/EcoRI primers Điện di DNA pEtM (5453bp) Restriction enzyme Ligase Điện di sản phẩm cắt nối
(2) Tạo vector tái tổ hợp pEtM-Pwo
(3) Biến nạp BL21 (DE3)
(4) Tách plasmid pEtM-Pwo
Điện di plasmid Bảo quản
(5) Giải trình tự Kiểm tra khung đọc
(1) PCR nhân gen Pwo DNA polymerase
Gen mã hóa Pwo DNA polymerase được khuếch đại bằng phương pháp PCR sử dụng khuôn plasmid PUC19-Pwo nhận từ công ty TNHH MTV Sinh Hóa Phù Sa (PHUSA Biochem). Tiến hành phản ứng PCR theo thành phần như trong bảng 7. Chu trình nhiệt độ cho phản ứng lần lượt với giai đoạn biến tính ban đầu 98oC/2 phút; 35 chu kỳ lặp lại của các bước biến tính 98oC/30 giây, gắn mồi 60oC/15 giây, kéo dài 72oC/1 phút; giai đoạn kéo dài cuối cùng 72oC/5 phút.
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 1%, chạy điện đi 100V, 30 phút. Bản gel được ngâm trong dung dịch chứa thuốc nhuộm ethidium bromide (EtBr), soi gel dưới đèn UV và chụp ảnh bởi hệ thống camera AlphaImager MINI (của Mỹ).
Bảng 7: Thành phần phản ứng PCR nhân dòng gen mã hóa Pwo-pol
Thành phần phản ứng Nồng độ Thể tích (µl) H2O pcr 34 Pwo-BamHI 10 µM 1.5 Pwo-EcoRI 10 µM 1.5 GC buffer 5X 10 dNTPs 10 mM 1
Phusion (Thermo) 2 U/µl 0.5
Khuôn PUC19-Pwo 10 ng/µl 1.5
Σ 50
(2) Tạo plasmid tái tổ hợp pEtM-Pwo
Sản phẩm PCR đem thôi gel sử dụng bộ kit thôi gel/tinh sạch MEGAquick- spin™ Total Fragment DNA Purification Kit của hãng iNtRon (Hàn Quốc) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Quy trình: tra toàn bộ thể tích sản phẩm PCR điện di trên gel agarose 1%, chạy điện di 100V, 30 phút. Cắt lấy băng đúng kích thước khoảng 2344 bp theo lý thuyết. Mảnh gel cắt ra có khối lượng không quá 0.3 g đem ủ với 500 µl dung dịch đệm BNL, ở 56oC khoảng 10 phút. Trong thời gian ủ, cứ 3 phút đảo hỗn hợp một lần cho đến khi mảnh gel tan hoàn toàn. Hỗn hợp đồng nhất thu được chuyển lên cột, ly tâm 11000g/30s, đổ bỏ dịch qua cột. Bổ sung 700 µl dung dịch đệm Wash để rửa các thành phần muối trong dung dịch đệm BNL còn bám trên cột, ly tâm
11000g/30s, đổ bỏ dịch rửa qua cột. Cột đem ly tâm khô ở tốc độ cao hơn 15000g/3’ để loại bỏ hoàn toàn cồn có trong dung dịch đệm rửa. Chuyển cột sang ống epp 1.5 ml mới, ủ lên màng cột 40 µl nước deion khoảng 5-10’, đem ly tâm 15000 g/1 phút. Dung dịch trong ống epp chứa DNA và plasmid đã tinh sạch, được bảo quản và sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo.
Sản phẩm tinh sạch chứa đoạn gen đích và vector pEtM được xử lý với enzyme cắt giới hạn theo thành phần liệt kê trong bảng 8, hỗn hợp được ủ ở 37oC liên tục trong 2 tiếng, để thu được sản phẩm cắt hoàn toàn. Sau đó tiếp tục tinh sạch theo quy trình của bộ kít thôi gel/tinh sạch MEGAquick-spin™ Total Fragment DNA Purification Kit (iNtRon). Mẫu tinh sạch bao gồm 30 µl gen mã hóa Pwo DNA polymerase và 30 µl plasmid (V) được trộn đều với 300 µl BNL buffer (5V), rồi đưa hỗn hợp lên cột. Thu hồi hỗn hợp DNA và plasmid với 40 µl nước PCR trước khi đem sử dụng cho phản ứng nối như bên dưới:
Bảng 8: Thành phần phản ứng cắt, nối gen và plasmid
Phản ứng cắt Pwo-DNA (V-µl) pEtM-Plasmid (V-µl) Phản ứng nối Thể tích (µL) H2O 23,5 31 T4 ligase 16
Fast Digest Buffer (10X) 4 4 Ligate buffer (10X) 2 DNA/Plasmid 10 3 DNA+Plasmid 2 BamHI 1 1 EcoRI 1,5 1 Σ 40 40 20
Phản ứng nối diễn ra ở nhiệt độ phòng. Nên sau khi trộn đều các dung dịch, ủ ống hỗn hợp ở nhiệt độ phòng (30oC) khoảng 2 tiếng. Sản phẩm sau khi nối được biến nạp ngay vào tế bào vi khuẩn E. coli.
(3) Biến nạp vào tế bào vi khuẩn E. coli BL21 (DE3)
Quy trình biến nạp sử dụng tế bào khả biến E. coli chủng BL21 (DE3), các thao tác được thực hiện trong tủ an toàn sinh học và làm sạch bề mặt khu vực trước khi thao tác bằng cồn 70o.
Chuẩn bị tế bào: lấy ống tế bào khả biến (100 µl) được bảo quản trong ni tơ lỏng, để giã đông trên đá khoảng 20 phút. Chia 50 µl tế bào khả biến vào ống epp 1.5 ml đã được bổ sung thêm 20 µl sản phẩm nối DNA và plasmid, ủ hỗn hợp trên đá 20 phút. Đem cả 2 ống tế bào sốc nhiệt ở 42oC/1 phút, lấy tế bào ra đặt trên đá 5
phút. Tiếp tục bổ sung vào 2 ống 600 µl LB lỏng, nuôi tĩnh ở 37oC/15 phút. Khi các tế bào biến nạp đã ổn định thì chuyển các ống sang nuôi lắc ở 37oC/30 phút để tế bào sinh trường.
Chuẩn bị đĩa thạch: môi trường LB agar, đĩa cấy đem khử trùng trước khi sử dụng. Quay môi trường trong lò vi sóng đến khi dung dịch đồng nhất, lấy 30 ml LB agar để nguội khoảng 40-50oC, bổ sung 30 µl ampicillin (100 mg/ml). Lắc đều dung dịch, sau đó chia ra 2 đĩa cấy (15 ml/đĩa), để đông khoảng 10 phút ở nhiệt độ phòng.
Biến nạp: đem 2 ống tế bào ly tâm nhẹ khoảng 6000 rpm/phút trong 2 phút ở
nhiệt độ phòng để loại bớt khoảng 500 µl dịch nuôi cấy. Lượng dịch và vi khuẩn còn lại trong ống trộn đều đem toàn bộ cấy trải trên đĩa thạch đã chuẩn bị. Đĩa thạch nuôi cấy đem ủ 37oC qua đêm (16-18 tiếng).
(4) Tách dòng plasmid tái tổ hợp pEtM-Pwo