Một trong những yêu cầu với việc sản xuất các enzyme DNA polymerase hiện nay ngoài khả năng chịu nhiệt thì chúng phải đảm bảo hoạt tính ổn định ngay cả khi phản ứng có mặt chất ức chế. Vì vậy, chúng tôi đã sử dụng khuôn DNA
genome tách chiết từ mô động vật theo phương pháp tách chiết phenol-chloroform để kiểm tra hoạt tính cho protein Pwo-pol tái tổ hợp thu được.
Mk (-) (+) T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 Mk (-) (+) T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 750bp 750bp 500bp 800bp 300bp 500bp 800bp 300bp a- b- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Hình 24: Hoạt tính của các proein Pwo-pol trong phản ứng sử dụng khuôn genome a. Protein Pwo-pol được tinh sạch theo phương pháp sắc ký ái lực kết hợp xử lý với nhiệt độ 70oC; b. Protein Pwo-pol được tinh sạch theo phương pháp sắc ký ái lực kết hợp xử lý với nhiệt độ 95oC. Đường chạy 1: marker iNtRon, đường chạy 2: đối chứng âm không bổ sung khuôn DNA, đường chạy 3: đối chứng dương được bổ sung khuôn DNA có chất lượng tốt, đường chạy 4 – 11: các mẫu genome tách chiết từ mẫu mô của dơi bảo quản bằng cồn trong thời gian dài. Kết quả điện di trên gel agarose 1%, 100V, 15 phút.
Kết quả điện di cho thấy một phần gen COI (~750 bp) đã được khuếch đại với protein Pwo-pol được tinh sạch theo phương pháp sắc ký ái lực kết hợp xử lý với nhiệt độ 95oC (hình 24a). Nếu ở hình a, sản phẩm khuếch đại được hầu như không thể nhìn rõ thì ở hình b đã xuất hiện băng đồng đều ở nhiều mẫu, các băng sáng rõ, đúng kích thước như đối chứng dương. Kết quả này chứng tỏ chúng tôi đã tối ưu được quy trình tinh sạch protein Pwo-pol tái tổ hợp có hoạt tính tốt, đảm bảo các hoạt tính vốn có của DNA polymerase bền nhiệt
Từ các kết quả thu được, chúng tôi cho rằng quy trình phá vỡ tế bào ở nhiệt độ 95oC/30’ kết hợp ly tâm ở nhiệt độ cao và tinh sạch bằng sắc ký ái lực nickel là một trong những phương pháp đơn giản để sản xuất protein Pwo-pol tái tổ hợp.
CHƯƠNG 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
Đề tài đã đạt được một số kết quả chính như sau:
1. Tối ưu được mã bộ ba của gen mã hóa protein Pwo DNA polymerase.
2. Nhân dòng thành công gen mã hóa Pwo DNA polymerase vào vector pET-M. 3. Biểu hiện được lượng lớn protein Pwo DNA polymerase tái tổ hợp ở vi khuẩn E. coli BL21 (DE3).
4. Tinh sạch được protein Pwo DNA polymerase tái tổ hợp có độ tinh sạch lên đến 95% khi áp dụng phương pháp đun nóng nhiệt độ cao kết hợp sắc ký ái lực đuôi 6xHis-tag.
5. Protein Pwo DNA polymerase tái tổ hợp thu được sau khi tinh sạch ở nhiệt độ cao có hoạt tính sao chép ổn định.
Kiến nghị
1. Kiểm tra mức độ nhiễm plasmid của protein Pwo DNA polymerase tái tổ hợp thu được sau khi tinh sạch.
2. Tối ưu quy trình xử lý DNA bằng enzyme cắt DNase I trước khi tinh sạch protein Pwo DNA polymerase tái tổ hợp
3. Kiểm tra độ chính xác của protein Pwo DNA polymerase tái tổ hợp sử dụng cặp mồi gây đột biến trực tiếp.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Abu Al-Soud W., Râdström P. (1998), "Capacity of nine thermostable DNA polymerases To mediate DNA amplification in the presence of PCR- inhibiting samples", Applied and environmental microbiology, 64, PP. 3748- 3753.
2. Albà M. M. (2001), "Replicative DNA polymerases", Genome Biology, 2, PP. reviews3002.1.
3. Asif A., Mohsin H., Tanvir R., Rehman Y. (2017), "Revisiting the Mechanisms Involved in Calcium Chloride Induced Bacterial Transformation", Frontiers in microbiology, 8, PP. 2169-2169.
4. Block H., Maertens B., Spriestersbach A., Brinker N., Kubicek J., Fabis R., Labahn J., Schäfer F. (2009), Chapter 27 Immobilized-Metal Affinity Chromatography (IMAC): A Review, Academic Press, Elsevier.
5. Chen C.-Y. (2014), "DNA polymerases drive DNA sequencing-by-synthesis technologies: both past and present", Frontiers in microbiology, 5, PP. 305- 305.
6. Dąbrowski S., Kur J. (1998), "Cloning and Expression in Escherichia coli of the Recombinant His-Tagged DNA Polymerases from Pyrococcus furiosus and Pyrococcus woesei", Protein Expression and Purification, 14, PP. 131-138. 7. Das-Bradoo S., Bielinsky A.-K. (2010), "DNA replication and checkpoint control
in S phase", Nature, 9, PP. 74-79.
8. DasSarma S., Coker J. A., DasSarma P. (2009), Archaea (overview), Academic Press, Oxford.
9. Dumon-Seignovert L., Cariot G., Vuillard L. (2004), "The toxicity of recombinant proteins in Escherichia coli: a comparison of overexpression in BL21(DE3), C41(DE3), and C43(DE3)", Protein Expression and Purification, 37, PP. 203-206.
10. Duong-Ly K. C., Gabelli S. B. (2014), Chapter Seven - Salting out of Proteins Using Ammonium Sulfate Precipitation, Academic Press, Elsevier.
11. Ecker D., Khan M. I., Marsh J., Butt T. R., Crooke S. T. (1987), "Chemical synthesis and expression of a cassette adapted ubiquitin gene", Journal of Biological Chemistry, 262, PP. 3524-3527.
12. Ghasemi A., Salmanian A. H., Sadeghifard N., Salarian A. A., Gholi M. K. (2011), "Cloning, expression and purification of Pwo polymerase from Pyrococcus woesei", Iranian journal of microbiology, 3, PP. 118-122.
13. Hayat S. M., Farahani N., Golichenari B., Sahebkar A. (2018), "Recombinant Protein Expression in Escherichia coli (E. coli): What We Need to Know",
Current pharmaceutical design, 24, PP. 718-725.
14. Henry I., Sharp P. M. (2006), "Predicting Gene Expression Level from Codon Usage Bias", Molecular Biology and Evolution, 24, PP. 10-12.
15. Heo J. H., Kim S. W. (2013), "Cloning the Pfu DNA polymerase from DNA contaminants in preparations of commercial Pfu DNA polymerase", African Journal of Microbiology Research, 7, PP. 745-750.
16. Hoseini S. S., Sauer M. G. (2015), "Molecular cloning using polymerase chain reaction, an educational guide for cellular engineering", Journal of biological engineering, 9, PP. 2-2.
17. Jia B., Jeon C. O. (2016), "High-throughput recombinant protein expression in Escherichia coli: current status and future perspectives", Open biology, 6, PP. 160196.
18. Kane J. F. (1995), "Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in Escherichia coli", Current Opinion in Biotechnology, 6, PP. 494-500.
19. Kanoksilapatham W., González J. M., Maeder D. L., DiRuggiero J., Robb F. T. (2004), "A proposal to rename the hyperthermophile Pyrococcus woesei as Pyrococcus furiosus subsp. woesei", Archaea (Vancouver, B.C.), 1, PP. 277- 283.
20. Kary M., Faloona F., Scharf S., Saiki R., Horn G., Erlich H. (1992), "Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. 1986", Biotechnology (Reading, Mass.), 24, PP. 17-27.
21. Khosravinia H., Ramesha K. (2007), "Influence of EDTA and magnesium on DNA extraction from blood samples and specificity of polymerase chain reaction", African Journal of Biotechnology (ISSN: 1684-5315) Vol 6 Num 3,
6, PP. 184-187.
22. Killelea T., Ralec C., Bossé A., Henneke G. (2014), "PCR performance of a thermostable heterodimeric archaeal DNA polymerase", Frontiers in microbiology, 5, PP. 195-195.
23. Kim S. W., Kim D.-U., Kim J. K., Kang L.-W., Cho H.-S. (2008), "Crystal structure of Pfu, the high fidelity DNA polymerase from Pyrococcus furiosus", International journal of biological macromolecules, 42, PP. 356- 361.
24. Kimple M. E., Brill A. L., Pasker R. L. (2013), "Overview of affinity tags for protein purification", Current protocols in protein science, 73, PP. 9.9.1- 9.9.23.
25. Lehman I. (2003), "Discovery of DNA polymerase", The Journal of biological chemistry, 278, PP. 34733-8.
26. Li X., Sui X., Zhang Y., Sun Y., Zhao Y., Zhai Y., Wang Q. (2009), "An improved calcium chloride method preparation and transformation of competent cells", Afr. J. Biotechnol., 9, PP. 8549-8554.
27. Li Z., Santangelo T. J., Čuboňová Ľ., Reeve J. N., Kelman Z. (2010), "Affinity Purification of an Archaeal DNA Replication Protein Network", mBio, 1, PP. e00221-10.
28. Makino T., Skretas G., Georgiou G. (2011), "Strain engineering for improved expression of recombinant proteins in bacteria", Microbial cell factories, 10, PP. 32-32.
29. Mandecki W., Boiling T. J. (1988), "FokI method of gene synthesis", Gene, 68, PP. 101-107.
30. Marsic D., Hughes R. C., Byrne-Steele M. L., Ng J. D. (2008), "PCR-based gene synthesis to produce recombinant proteins for crystallization", BMC Biotechnology, 8, PP. 44.
31. Pavlov A. R., Pavlova N. V., Kozyavkin S. A., Slesarev A. I. (2004), "Recent developments in the optimization of thermostable DNA polymerases for efficient applications", Trends in Biotechnology, 22, PP. 253-260.
33. Puigbò P., Bravo I. G., Garcia-Vallve S. (2008), "CAIcal: A combined set of tools to assess codon usage adaptation", Biology Direct, 3, PP. 38.
34. Robb F. T., Maeder D. L., Brown J. R., DiRuggiero J., Stump M. D., Yeh R. K., Weiss R. B., Dunn D. M. (2001), Genomic sequence of hyperthermophile, Pyrococcus furiosus: implications for physiology and enzymology, Academic Press, Elsevier.
35. Roymondal U., Das S., Sahoo S. (2009), "Predicting gene expression level from relative codon usage bias: an application to Escherichia coli genome", DNA research : an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes, 16, PP. 13-30.
36. Sanger F., Coulson A. R. (1975), "A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase", Journal of Molecular Biology, 94, PP. 441-448.
37. Sclafani R. A., Holzen T. M. (2007), "Cell cycle regulation of DNA replication", Annual review of genetics, 41, PP. 237-280.
38. Spriestersbach A., Kubicek J., Schäfer F., Block H., Maertens B. (2015),
Chapter One - Purification of His-Tagged Proteins, Academic Press, Elsevier.
39. Steitz T. A. (1999), "DNA polymerases: structural diversity and common mechanisms", The Journal of biological chemistry, 274, PP. 17395-17398. 40. Terpe K. (2013), "Overview of thermostable DNA polymerases for classical
PCR applications: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems", Applied Microbiology and Biotechnology, 97, PP. 10243-10254.
41. Wingfield P. (2001), "Protein precipitation using ammonium sulfate", Current protocols in protein science, Appendix 3, PP. Appendix-3F.
42. Yang G., Wang S., Wei H., Ping J., Liu J., Xu L., Zhang W. (2011), "Patch oligodeoxynucleotide synthesis (POS): A novel method for synthesis of long DNA sequences and full-length genes", Biotechnology letters, 34, PP. 721-8. 43. Yoda T., Tanabe M., Tsuji T., Yoda T., Ishino S., Shirai T., Ishino Y.,
Takeyama H., Nishida H. (2017), "Exonuclease processivity of archaeal replicative DNA polymerase in association with PCNA is expedited by mismatches in DNA", Scientific reports, 7, PP. 44582-44582.
44. Zhang L., Kang M., Xu J., Huang Y. (2015), "Archaeal DNA polymerases in biotechnology", Applied microbiology and biotechnology, 99, PP. 6585- 6597.
45. Zhang Z., Kuipers G., Niemiec Ł., Baumgarten T., Slotboom D. J., de Gier J.- W., Hjelm A. (2015), "High-level production of membrane proteins in E. coli BL21(DE3) by omitting the inducer IPTG", Microbial cell factories, 14, PP. 142-142.
46. Zillig W., Holz I., Klenk H.-P., Trent J., Wunderl S., Janekovic D., Imsel E., Haas B. (1987), "Pyrococcus woesei, sp. nov., an ultra-thermophilic marine archaebacterium, representing a novel order, Thermococcales", Systematic and Applied Microbiology, 9, PP. 62-70.