a. Khả năng sao chép DNA trong in vitro
Protein Pwo DNA polymerase của vi khuẩn P. woesei là một enzyme có hoạt tính xúc tác cho quá trình sao chép DNA. Để xác định protein tái tổ hợp Pwo DNA polymerase có hoạt tính sau khi tinh sạch cần tiến hành phản ứng PCR trong ống nghiệm với thành phần và điều kiện thích hợp. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng plasmid và cặp mồi nhân đoạn gen AcrH kích thước khoảng 400 bp để xác định hoạt tính của protein tái tổ hợp thu được. Thành phần phản ứng PCR xác định hoạt tính như trong bảng 11:
Bảng 11: Thành phần phản ứng PCR thử hoạt tính nhân đoạn gen AcrH
Thành phần phản ứng Nồng độ Thể tích (µl) H2O pcr 7.4 AcrH-F 10 µM 0.3 AcrH-R 10 µM 0.3 Buffer PCR, pH 8.0 10X 1 dNTPs 10 mM 0.2 PwoMCB 0.5 Khuôn Duet-AcrH 10 ng/µl 0.3 Σ 10
Chu trình nhiệt tối ưu được sử dụng bao gồm giai đoạn biến tính ban đầu 95oC/3 phút; 35 chu kỳ lặp lại của các bước biến tính 95oC/15 giây, gắn mồi 57oC/15 giây, kéo dài 72oC/30 giây; giai đoạn kéo dài cuối cùng 72oC/5 phút.
b. Khả năng chịu nhiệt độ cao trong sao chép in vitro
Protein Pwo DNA polymerase có khả năng chịu nhiệt độ cao, đây là một trong những đặc điểm nổi trội được chúng tôi tiến hành đánh giá. Kết quả được so sánh với enzyme Taq DNA polymerse sản xuất thương mại để có kết luận chính xác và đáng tin cậy. Vì vậy, các enzme cần đánh giá sẽ được heat nhiệt độ cao ở bước biến tính đầu tiên trong chuỗi phản ứng PCR lên đến 98oC/5 phút. Các bước khác tiến hành tương tự như một phản ứng PCR thông thường, sử dụng khuôn và mồi nhân đoạn gen có kích thước nhỏ (khoảng 400 bp) như đã miêu tả ở trên.
c. Khả năng kéo dài chuỗi trong sao chép in vitro
Từ các phương pháp tinh sạch khác nhau, và quá trình tối ưu, protein Pwo DNA polymerase được kiểm tra nếu có hoạt tính sao chép sẽ tiếp tục đánh giá khả năng kéo dài chuỗi. Sử dụng plasmid và cặp mồi nhân đoạn gen KOD kích thước khoảng hơn 2 kb với thành phần phản ứng lần lượt như trong bảng dưới đây:
Bảng 12: Thành phần phản ứng PCR thử hoạt tính nhân đoạn gen KOD
Thành phần phản ứng Nồng độ Thể tích (µl) H2O pcr 7.4 KOD-F 10 µM 0.3 KOD-R 10 µM 0.3 Buffer PCR, pH 8.0 10X 1 dNTPs 10 mM 0.2 PwoMCB 0.5 Khuôn pEtM-KOD 10 ng/µl 0.3 Σ 10
Chu trình nhiệt được sử dụng cho phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen này bao gồm giai đoạn biến tính ban đầu 95oC/3 phút; 35 chu kỳ lặp lại của các bước biến tính 95oC/15 giây, gắn mồi 55oC/15 giây, kéo dài 72oC/2 phút; giai đoạn kéo dài cuối cùng 72oC/5 phút.
d. Khả năng sao chép in vitro khi có mặt chất ức chế
nghiên cứu này chúng tôi sử dụng mẫu DNA genome từ mô động vật, tách chiết theo phương pháp phenol-chlorophom cho các phản ứng PCR thử hoạt tính này. Một phần đoạn gen COI được khuếch đại với cặp mồi universal VF1d/VR1d. Thành phần phản ứng và chu kỳ nhiệt tương tự như một phản ứng PCR thông thường, sử dụng khuôn và mồi nhân đoạn gen AcrH có kích thước khoảng 400 bp như đã miêu tả ở mục 2.26-a.
e. Tối ưu thành phần buffer PCR và buffer bảo quản
Chúng tôi mong muốn thu được một lượng lớn protein có nồng độ cao, không lẫn các protein tạp khác. Tuy nhiên khi protein ở nồng độ cao thường dễ bị kết tủa. Với điều kiện phòng thí nghiệm thông thường chỉ có thể bảo quản mẫu ở nhiệt độ -20oC đến -30oC. Vì vậy, protein tái tổ hợp sau tinh sạch đem cần bảo quản trong glycerol có bổ sung một số thành phần giúp làm ổn định hoạt tính của protein.
Bảng 13: Thành phần buffer bảo quản protein Pwo-pol
Storage buffer Tris-HCl [mM] KCl [mM] EDTA [mM] DTT [mM] Tween 20 (v/v) NP40 (v/v) Glycerol (v/v) Pwo, Roche 20, pH7.5 100 0,1 1 0.5% 0.5% 50% MCB v2 20, pH8.0 100 0,1 1 0.5% 0.5% 50%
Chú ý: protein Pwo DNA polymerase sau khi thẩm tách được bổ sung ngay các thành phần bảo quản tương ứng như trong bảng.
Bảng 14: Thành phần 10X buffer PCR tối ưu hoạt tính của protein Pwo-pol
10X buffer PCR Tris-HCl [mM] KCl [mM] (NH4)2SO4 [mM] MgSO4 [mM] Triton X (v/v) BSA [mg/ml] pH 7.5 v1 200 100 100 20 1% 1 pH 8.0 v1 200 100 100 20 1% 1 pH 8.8 v1 200 100 100 20 1% 1 pH 8.8 v2 200 250 100 20 1% 1
Chúng tôi đã tham khảo thành phần buffer cho DNA polymerase từ các nghiên cứu trước đây và đem so sánh với các hãng enzyme thương mại để chọn ra được một số buffer phù hợp như trong bảng 13; 14. Các buffer bảo quản và một số phiên bản khác nhau của buffer PCR sử dụng để tối ưu cho phản ứng PCR trong nghiên cứu này, được ký hiệu là buffer MCB.
CHƯƠNG 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN