Dịch siêu âm (4) Kết tủa
Ammoniun Sulfate
Tế bào Biểu hiện Pwo-pol Phá vỡ tế bào Bằng nhiệt Phá vỡ tế bào Sóng siêu âm 95oC/30’ Hồi tính/đá Sucrose 20% Vortex/15’ Phá vỡ tế bào Sốc thẩm thấu Ly tâm Ly tâm (1) Sắc ký ái lực Ly tâm Dịch phá vỡ ở 95oC 70oC/1h Dịch phá vỡ bằng sucrose Ly tâm Dịch phá vỡ ở 70oC (2) Sắc ký ái lực + nhiệt độ 70oC (3) Sắc ký ái lực + nhiệt độ 95oC 95oC/30’
Hình 9: Sơ đồ quá trình tinh sạch protein Pwo-pol
Pwo DNA polymerase là một trong những loại enzyme sản xuất nội bào, nên cần được giải phóng ra ngoài trước khi muốn thu hồi. Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng kết hợp một vài phương pháp phá vỡ tế bào cho vi khuẩn gram âm E. coli để giải phóng các protein tái tổ hợp ra ngoài dung dịch như:
Phương pháp siêu âm (ultrasound): sử dụng hệ thống máy siêu âm cung
cấp các xung năng lượng điện áp cao ở tần số 20 kHz, sau đó được chuyển đổi thành các rung động cơ học. Rung động được khuếch đại, truyền xuống dọc theo đầu dò (Ф 1 mm) với biên độ cài đặt 40%. Quá trình siêu âm có thể kéo dài từ 1- 2 tiếng, với chu kỳ liên tục sau 5 giây xung bật là 5 giây xung nghỉ.
Phương pháp gây sốc thẩm thấu (osmotic shock): tế bào tiếp xúc với dung
dịch đệm rửa (30 mM Tris HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA) không chứa sucrose, nước sẽ đi vào tế bào. Sau đó, sử dụng dung dịch đệm tương tự được bổ sung sucrose với nồng độ cao khoảng 20-30% (g/ml).
Phương pháp ly giải nhiệt (thermolysis): được sử dụng phổ biến trong sản
xuất ở quy mô lớn. Protein gian màng (periplasmic proteins) của vi khuẩn gram âm bị giải phóng khi các tế bào được làm nóng lên đến 50oC. Protein tế bào chất của E. coli có thể được giải phóng hoàn toàn trong 10 phút ở 90oC. Trong nghiên cứu này, các tế bào có thể được làm nóng từ 70oC trong 1 tiếng, hoặc 95oC liên tục trong 30 phút. Sau đó, hỗn hợp protein đem ủ trên đá 30 phút để hồi tính.
Có một điểm đặc biệt đáng lưu ý là khi đun nóng ở nhiệt độ cao, các protein không có khả năng chịu nhiệt của vi khuẩn E. coli có thể bị kết tủa, nên đây có thể là một phương pháp được kết hợp để tinh sạch protein tái tổ hợp Pwo-pol và loại bỏ các protein tạp từ E. coli.
b. Các phương pháp tinh sạch protein
Phương pháp (1): Tinh sạch sắc ký ái lực (6xHis-tag) với nickel
Tế bào vi khuẩn biểu hiện từ 100 ml môi trường đem hòa với 10 ml dung dịch đệm A1 (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 5 mM Imidazole), tiến hành phá vỡ tế bào theo cả 2 cách siêu âm và nhệt phân. Hỗn hợp dung dịch chứa tế bào bị phá vỡ được ly tâm ở tốc độ cao 14000 rpm/30 phút ở 4oC, thu dịch ly tâm.
Cung cấp khoảng 1.5 ml NiCl2 50 mM lên cột, ủ 3-5 phút để Ni2+ gắn vào hạt gel. Rửa cột với 3-5 ml dung dịch đệm A1, rồi đem ủ dịch ly tâm trên cột khoảng 10 phút, thu dịch qua cột để điện di kiểm tra. Rửa cột nhiều lần và liên tục
với 50ml dung dịch đệm B1 (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 30 mM Imidazole). Nồng độ imidazole trong bước rửa ở mức thấp, nhưng dễ dàng rửa trôi các protein không chứa đuôi poly-histidine. Nếu protein tái tổ hợp khó tinh sạch, có thể tăng nồng độ imidazole trong đệm B1 lên khoảng 60-100 mM.
Rút bỏ hòa toàn dung dịch có trong cột trước khi thu lại protein tái tổ hợp bằng 4 ml đệm C1 (50 mM Tris, 300 mM NaCl, 500 mM Imidazole). Nồng độ imidazole trong đệm C1 rất cao đóng vai trò cạnh tranh với đuôi 6xHis liên kết với nickel. Khi đó, nickel liên kết với imidazole tự do sẽ giải phóng protein tái tổ hợp ra môi trường. Dịch qua cột chứa protein tái tổ hợp sẽ được tối ưu điều kiện bảo quản và đánh giá hoạt tính.
Tái sử dụng resin bằng đệm TEN buffer (20 mM Tris, 100 mM EDTA, 500 mM NaCl, pH 8.0)
Phương pháp (2): Kết tủa ammonium sulfate
Tế bào vi khuẩn biểu hiện từ 100 ml môi trường đem hòa với 10 ml (V) dung dịch đệm A2 (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA), vortex tế bào trong 5 phút rồi đem ly tâm, đổ bỏ dung dịch rửa. Tiếp tục hòa cặn tế bào với 10 ml (V) dung dịch đệm B2 (50 mM Tris HCl, 20% sucrose, 1 mM EDTA), vortex dung dịch trong 10 phút để phá vỡ tế bào theo phương pháp sốc thẩm thấu. Để so sánh mức độ phá vớ tế bào, làm tương tự các bước trên, thay đệm B2 thành đệm C2 (50 mM Tris HCl, 300 mM NaCl), dùng máy siêu âm phá vỡ tế bào trong 2 tiếng. Ly tâm thu dịch phá vỡ rồi bổ sung thêm muối ammonium sulfate với lượng từ 20-60% độ bão hòa, ủ mẫu qua đêm ở 4oC. Ly tâm dung dịch thu tủa, hòa tủa với 1/5V dung dịch đệm C2, để mẫu tan tự nhiên ở 4oC sau 10 phút.
c. Thẩm tách
Theo nguyên lý của sự khuếch tán, chúng tôi sử dụng màng thẩm tách có tính chất bán thấm để làm giảm nồng độ muối và imdazole có trong hỗn hợp dung dịch tinh sạch. Sau đó, chúng được thẩm tách trong dung dịch đệm có nồng độ muối thấp hơn và không chứa imidazole (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 200 mM NaCl), ở 4oC. Tùy vào lượng (thể tích, nồng độ) các chất trong hỗn hợp để sử dụng thể tích dung dịch đệm thẩm tách tương ứng (tỉ lệ 1 hỗn hợp:20 đệm). Sau 7-8 tiếng thay đệm thẩm tách một lần, liên tục thay đệm 3 lần.
Các mẫu trong quá trình biểu hiện và tinh sạch protein Pwo DNA polymerase được điện di kiểm tra trên gel SDS-PAGE thành phần như bảng 10, chạy điện di 120V, 90 phút.
Bản gel được ngâm trong đệm nhuộm 30 phút, rồi chuyển sang ngâm trong đệm tẩy 30 phút. Rửa lại bản gel, ngâm nước trước khi chụp ảnh phân tích.
Bảng 10: Thành phần hóa chất đổ gel điện di SDS-PAGE
Thành phần hóa chất Gel tách (10%) Gel cô (5%)
H2O 3.162 ml 1.687 ml Acrylamide/Bis 30% 2.67 ml 0.5 ml Tris HCl, 1M pH 8.8 2 ml Tris HCl, 1M pH 6.8 0.75 ml SDS 10% 80 µl 30 µl APS 10% 80 µl 30 µl TEMED 8 µl 3 µl Σ 8 ml 3 ml