3.2.1. Tạo vector tái tổ hợp pEtM-Pwo
Mk 1kb Pwo 2344bp 2kb 1kb 250bp 3kb a- 1 2 Mk 1kb b- 1 2 3 4 5
Hình 10: Khuếch đại gen mã hóa Pwo-pol và xử lý enzyme cắt giới hạn
Kết quả điện di trên gel agarose 1%, a- sản phẩm PCR nhân dòng gen mã hóa Pwo DNA polymerase sử dụng cặp mồi chứa vị trí cắt enzyme giới hạn, marker 1kb của hãng iNtRon (đường chạy 1) được sử dụng để so sánh kích thước của gen Pwo khuếch đại (đường chạy 2); b- Sản phẩm cắt đồng thời plasmid pEtM (đường chạy 1;2) và gen mã hóa Pwo DNA pol (đường chạy 4;5) bằng hai enzyme cắt giới hạn EcoRI và BamHI so sánh với marker 1 kb của hãng iNtRon (đường chạy 3).
Kết quả điện di sản phẩm PCR (hình 10a) cho thấy đã nhân dòng chính xác được đoạn gen mã hóa Pwo DNA polymerase. Sản phẩm nhân gen thể hiện một băng sáng rõ có kích thước khoảng 2344 bp theo lý thuyết. Tuy nhiên, kết quả PCR cũng cho thấy một số băng phụ phía trên băng chính (khoảng 4-5 kb). Vì vậy, sản phẩm PCR đã được thôi gel trước khi sử dụng cho phản ứng cắt enzyme giới hạn.
Tiếp tục đánh giá kết quả kiểm tra cắt gen và plasmid với cả 2 enzyme cắt giới hạn EcoRI và BamHI được điện di trên gel agarose 1% (hình 10b). Plasmid pEtM trước khi cắt bao gồm các băng chính sáng rõ tương ứng với các dạng của plasmid (xoắn, vòng và siêu xoắn). Plasmid sau khi cắt với enzyme giới hạn thu được 1 băng sáng với kích thước khoảng 6 kb tương ứng với kích thước được mở vòng. Do đó, enzyme đã cắt chính xác tại các vị trí cắt giới hạn mong muốn trên vector biểu hiện. Tuy nhiên plasmid có thể chưa được cắt hoàn toàn do vẫn quan sát thấy một băng mờ ở phía dưới băng plasmid cắt (đường chạy 1). Mặt khác, đoạn gen trước và sau khi cắt đã thu được kích thước bằng nhau từ kết quả điện di này. Điều này chứng tỏ đoạn gen đã được cắt đúng vị trí cắt giới hạn ở 2 đầu, cũng như
đoạn gen không chứa vị trí cắt bên trong. Vì vậy có thể tiến hành phản ứng nối bình thường cho gen và plasmid, tạo plasmid tái tổ hợp pEtM-Pwo.
3.2.2. Biến nạp vector tái tổ hợp pEtM-Pwo vào vi khuẩn E. coli BL21 (DE3)
a- 1kb Mk 1Kb Clone 1 Clone 2 Clone 3 2599 bp 266 bp 1 2 3 4 2kb 250bp 3kb b-
Hình 11: Biến nạp, nuôi cấy, chọn lọc plasmid tái tổ hợp pEtM-Pwo
a- Tế bào khả biến E. coli BL21 (DE3) bổ sung plasmid tái tổ hợp pEtM-Pwo cấy trải trên đĩa thạch bổ sung ampicilin. b- Kết quả điện di trên gel agarose 1% sản phẩm PCR chọn lọc khuẩn lạc chứa plasmid tái tổ hợp pEtM-Pwo, marker 1kb của hãng iNtRon (đường chạy 1) được sử dụng để so sánh kích thước của đoạn gen khuếch đại bằng cặp mồi T7 từ 3 khuẩn lạc tương ứng (đường chạy 2; 3; 4).
Đĩa thạch nuôi cấy tế bào khả biến có xuất hiện nhiều khuẩn lạc mọc cách đều nhau như hình 11a. Như vậy, đã biến nạp thành công hỗn hợp plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn E. coli. Kết quả biến nạp là đáng tin cậy khi đã được so sánh với đĩa đối chứng không bổ sung hỗn hợp plasmid tái tổ hợp, không quan sát thấy khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch. Như vậy tế bào khả biến sử dụng trong quá trình biến nạp không bị nhiễm gen hoặc plasmid kháng kháng sinh.
Tuy nhiên khuẩn lạc mọc trên đĩa nuôi cấy bổ sung kháng sinh ampicilin (10 µg/ml) có thể xảy ra 2 trường hợp: (1) chứa plasmid tái tổ hợp hoặc (2) chứa plasmid chưa cắt hoàn toàn từ hỗn hợp sản phẩm cắt và nối enzyme giới hạn ở trên. Do đó, tiến hành chọn lựa 3 khuẩn lạc từ đĩa nuôi cấy, các khuẩn lạc mọc riêng rẽ, to, tròn đều sẽ được đem PCR kiểm tra hiệu suất chèn gen của phản ứng cắt nối.
Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra khuẩn lạc được chọn cho thấy, khuẩn lạc số 2 và 3 có mang plasmid tái tổ hợp được chèn thành công đoạn gen mã hóa Pwo-pol (hình 11b). Sản phẩm PCR từ hai khuẩn lạc này xuất hiện các băng có
với lý thuyết đoạn gen đích được nhân lên từ cặp mồi T7 cho kích thước là 2599 bp. Trong khi đó, khuẩn lạc số 1 mang plamid chưa chèn thành công đoạn gen đích, với cặp mồi T7 chỉ nhân lên sản phẩm PCR với kích thước khoảng hơn 250 bp.
3.2.3. Tách plasmid, kiểm tra trình tự
Nồng độ plasmid Stock x50 x100 pEtM Pwo 2599bp 2kb 1kb 500bp 4kb 6kb (-) 1 2 3 4 5 6 Mk 1kb
Hình 12: Tách chiết và kiểm tra plasmid tái tổ hợp
Kết quả điện di trên gel agarose 1% plasmid tái tổ hợp pEtM-Pwo sau khi tách chiết (đường chạy 2) và đoạn gen đích được khuếch đại bằng cặp mồi T7 với các nồng độ khuôn plasmid khác nhau (đường chạy 3; 4; 5), đối chứng âm là phản ứng không bổ sung khuôn plasmid (đường chạy 6). Kích thước được so sánh với marker 1 kb của iNtRon (đường chạy 1)
Plasmid tái tổ hợp thu được theo như kết quả điện di bao gồm hai băng rõ nét có kích thước khoảng 3 kb tương ứng với dạng siêu xoắn và 8 kb tương ứng với dạng vòng của plasmid. Các kích thước của plasmid thu được hoàn toàn phù hợp với lý thuyết sau khi chèn thành công đoạn gen mã hóa Pwo-pol hơn 2 kb vào vector pEtM có kích thước khoảng 6 kb. Vì vậy, chúng tôi đã tách chiết thành công, thu được plasmid tái tổ hợp pEtM-Pwo.
Plasmid tái tổ hợp thu được đã được chèn gen chính xác bởi phản ứng kiểm tra PCR bằng cặp mồi T7. Với cả 3 nồng độ khuôn plasmid sử dụng trong phản ứng PCR đều cho kết quả là một băng điện di duy nhất có kích thước khoảng 2599 bp theo lý thuyết. Kết quả PCR kiểm tra là đáng tin cậy khi so sánh với đối chứng âm không lên băng tương ứng.
Do đó, sản phẩm PCR thu được từ thí nghiệm có băng sáng rõ, không chứa băng phụ đã được tinh sạch và gửi giải trình tự. Kết quả kiểm tra sự ghép nối chính xác gen Pwo vào khung đọc mở chứa đuôi 6xHis-tag và trình tự cắt thrombin của
plasmid pEtM như phân tích bên dưới. Dữ liệu phân tích trình tự acid amin này cho thấy không có sự xuất hiện của các đột biến thay thế hoặc chèn sai khung đọc mở của đoạn gen đích trong quá trình nhân dòng và biến nạp.
P.woesei ---MILDVDYITEEGKPVIRLFKKENGKFKIEHDRTFRPYIYALLRDD Pwo-tái tổ hợp MHHHHHHSSGLVPRGSILDVDYITEEGKPVIRLFKKENGKFKIEHDRTFRPYIYALLRDD ******************************************** P.woesei SKIEEVKKITGERHGKIVRIVDVEKVEKKFLGKPITVWKLYLEHPQDVPTIREKVREHPA Pwo-tái tổ hợp SKIEEVKKITGERHGKIVRIVDVEKVEKKFLGKPITVWKLYLEHPQDVPTIREKVREHPA ************************************************************ P.woesei VVDIFEYDIPFAKRYLIDKGLIPMEGEEELKILAFDIETLYHEGEEFGKGPIIMISYADE Pwo-tái tổ hợp VVDIFEYDIPFAKRYLIDKGLIPMEGEEELKILAFDIETLYHEGEEFGKGPIIMISYADE ************************************************************ P.woesei NEAKVITWKNIDLPYVEVVSSEREMIKRFLRIIREKDPDIIVTYNGDSFDFPYLAKRAEK Pwo-tái tổ hợp NEAKVITWKNIDLPYVEVVSSEREMIKRFLRIIREKDPDIIVTYNGDSFDFPYLAKRAEK ************************************************************ P.woesei LGIKLTIGRDGSEPKMQRIGDMTAVEVKGRIHFDLYHVITRTINLPTYTLEAVYEAIFGK Pwo-tái tổ hợp LGIKLTIGRDGSEPKMQRIGDMTAVEVKGRIHFDLYHVITRTINLPTYTLEAVYEAIFGK ************************************************************ P.woesei PKEKVYADEIAKAWESGENLERVAKYSMEDAKATYELGKEFLPMEIQLSRLVGQPLWDVS Pwo-tái tổ hợp PKEKVYADEIAKAWESGENLERVAKYSMEDAKATYELGKEFLPMEIQLSRLVGQPLWDVS ************************************************************ P.woesei RSSTGNLVEWFLLRKAYERNEVAPNKPSEEEYQRRLRESYTGGFVKEPEKGLWENIVYLD Pwo-tái tổ hợp RSSTGNLVEWFLLRKAYERNEVAPNKPSEEEYQRRLRESYTGGFVKEPEKGLWENIVYLD ************************************************************ P.woesei FRALYPSIIITHNVSPDTLNLEGCKNYDIAPQVGHKFCKDIPGFIPSLLGHLLEERQKIK Pwo-tái tổ hợp FRALYPSIIITHNVSPDTLNLEGCKNYDIAPQVGHKFCKDIPGFIPSLLGHLLEERQKIK ************************************************************ P.woesei TKMKETQDPIEKILLDYRQKAIKLLANSFYGYYGYAKARWYCKECAESVTAWGRKYIELV Pwo-tái tổ hợp TKMKETQDPIEKILLDYRQKAIKLLANSFYGYYGYAKARWYCKECAESVTAWGRKYIELV ************************************************************ P.woesei WKELEEKFGFKVLYIDTDGLYATIPGGESEEIKKKALEFVKYINSKLPGLLELEYEGFYK Pwo-tái tổ hợp WKELEEKFGFKVLYIDTDGLYATIPGGESEEIKKKALEFVKYINSKLPGLLELEYEGFYK ************************************************************ P.woesei RGFFVTKKRYAVIDEEGKVITRGLEIVRRDWSEIAKETQARVLETILKHGDVEEAVRIVK Pwo-tái tổ hợp RGFFVTKKRYAVIDEEGKVITRGLEIVRRDWSEIAKETQARVLETILKHGDVEEAVRIVK ************************************************************ P.woesei EVIQKLANYEIPPEKLAIYEQITRPLHEYKAIGPHVAVAKKLAAKGVKIKPGMVIGYIVL Pwo-tái tổ hợp EVIQKLANYEIPPEKLAIYEQITRPLHEYKAIGPHVAVAKKLAAKGVKIKPGMVIGYIVL ************************************************************ P.woesei RGDGPISNRAILAEEYDPKKHKYDAEYYIENQVLPAVLRILEGFGYRKEDLRYQKTRQVG Pwo-tái tổ hợp RGDGPISNRAILAEEYDPKKHKYDAEYYIENQVLPAVLRILEGFGYRKEDLRYQKTRQVG ************************************************************ P.woesei LTSWLNIKKS Pwo-tái tổ hợp LTSWLNIKKS **********
Hình 13: So sánh trình tự amino acid của gen mã hóa Pwo DNA polymerase Các trình tự amino acid kí hiệu P. woesei (tương ứng cho Pwo-pol trong tự nhiên) và Pwo- tái tổ hợp (tương ứng trong thí nghiệm) được dóng hàng bằng phần mềm ClustalW online. Đuôi peptide chứa 6 histidine (màu đỏ), và trình tự cắt gồm 6 acid amin của thrombin (màu xanh). Dấu “*” thể hiện sự tương đồng giữa các acid amin của hai trình tự.
3.3. Biểu hiện protein Pwo DNA polymerase ở vi khuẩn E. coli1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 Mk 72 55 42 26 kDa 92 kDa
Hình 14: Biểu hiện protein DNA polymerase ở E. coli
Đường chạy 1: marker protein, đường chạy 2: mẫu đối chứng không bổ sung IPTG, đường chạy 3: mẫu vi khuẩn nuôi biểu hiện ở 25oC trong 16h, đường chạy số 4; 5: mẫu vi khuẩn nuôi biểu hiện ở 37oC trong 16h. Các mẫu biểu hiện điện di trên gel SDS-PAGE 10%, 120V, 90 phút.
Kết quả tối ưu biểu hiện protein Pwo-pol với các nồng độ IPTG ở nhiệt độ khác nhau được chỉ ra như hình 14. Cả ba mẫu biểu hiện với IPTG (0.1 mM hoặc 0.3 mM ở 37oC hoặc 25oC) đều cho băng biểu hiện kích thước khoảng trên 92 kDa theo lý thuyết. Các kết quả biểu hiện là đáng tin cậy khi so sánh với các đường chạy đối chứng (không có IPTG), thấy không có sự biểu hiện protein. Chứng tỏ chất cảm ứng IPTG đã kích hoạt quá trình biểu hiện protein tái tổ hợp Pwo-pol như mong muốn. Tiếp tục so sánh kết quả biểu hiện protein Pwo-pol ở cùng nồng độ IPTG 0.3 mM, thấy có sự khác biệt khi biểu hiện protein ở nhiệt độ 37oC mức độ biểu hiện cao hơn ở nhiệt độ phòng (25-30oC). Như vậy, ở nồng độ IPTG 0.1 - 0.3 mM và nhiệt độ 37oC là tối ưu nhất cho khả năng biệu hiện của protein Pwo-pol ở tế bào vi khuẩn E. coli BL21 (DE3).
3.4. Tinh sạch protein tái tổ hợp Pwo DNA polymerase
Pwo DNA polymerase tái tổ hợp là một protein có kích thước lớn khoảng 92 kDa. Và việc tinh sạch một protein có kích thước lớn như vậy sẽ gặp phải một số khó khăn. Do đó, chúng tôi đã thử nghiệm một số quy trình tinh sạch cho protein này như: tinh sạch sắc ký ái lực, tinh sạch sắc ký ái lực kết hợp nhiệt độ cao giúp loại bỏ protein của E. coli và phương pháp kết tủa AS.
3.4.1. Phương pháp tinh sạch sắc ký ái lực nickel
Dưới đây là kết quả so sánh sự phá vỡ tế bào khi có sự kết hợp phương pháp siêu âm với nhiệt độ cao. Bước đầu đánh giá khả năng tinh sạch của các phương pháp khác nhau. Mk 26 42 55 72 1 2 3 4 5 6 kDa 92 kDa
Hình 15: So sánh sự phá vỡ tế bào với nhiệt độ cao
Mẫu vi khuẩn biểu hiện ở nồng độ IPTG 0.3 mM/16h được siêu âm phá vỡ tế bào, sau đó xử lý nhiệt tương ứng. Ở đường chạy 1: marker protein, đường chạy 2: dịch siêu âm sau khi ly tâm, không xử lý nhiệt, đường chạy số 3; 4 cặn phá vỡ tế bào thu được sau khi siêu âm kết hợp xử lý với nhiệt độ lần lượt 70oC và 95oC, đường chạy số 5; 6 dịch phá vỡ tế bào sau khi siêu âm kết hợp xử lý nhiệt độ lần lượt 70oC và 95oC. Các mẫu protein được điên di trên gel SDS-PAGE 10%, 120V, 90 phút.
Pwo-pol có nguồn gốc từ vi khuẩn Cổ ưa nhiệt, độ bền ít nhất là 2h ở 100oC. Do đó, chúng tôi tiến hành xử lý tế bào ở nhiệt độ cao khoảng từ 70-95oC trước khi tinh sạch. Kết quả được so sánh với mẫu tế bào không xử lý nhiệt (mẫu tế bào siêu âm trên đá lạnh). Tuy nhiên, khi thử mẫu với nhiệt độ cao trong thời gian dài có thể làm giảm hoạt tính của protein thu được sau tinh sạch [15]. Nên chúng tôi đã thực hiện xử lý tế bào với nhiệt độ 70oC tối đa 1h ủ mẫu liên tục, còn với nhiệt độ 95oC tối đa là 30 phút liên tục. Kết quả đáng chú ý, mức độ loại bỏ các protein của E. coli
trong dịch phá vỡ tế bào biểu hiện tăng dần theo nhiệt độ: trên đá lạnh < 70oC < 95oC. Từ kết quả này, tiếp tục tối ưu phương pháp tinh sạch với cột sắc ký ái lực nilel để loại bỏ những protein không có gắn đuôi 6xHis-tag.
a. Sử dụng mẫu tế bào biểu hiện được phá vỡ bằng sóng siêu âm
Trong quy trình này, chúng tôi tiến hành tất cả các thao tác trên đá lạnh, đảm bảo protein không bị biến tính, hay ảnh hưởng khác bởi nhiệt độ.
26 42 55 72 Mk 1 2 3 4 5 6 7 kDa 72 55 42 26 Mk 5 4 3 2 1 kDa 92 kDa a- b-
Hình 16: Mẫu siêu âm phá vỡ tế bào tinh sạch sắc ký ái lực
a- Quy trình tinh sạch sắc ký ái lực sử dụng máy siêu âm phá vỡ tế bào, đường chạy 1: marker protein, đường chạy 2; 3 lần lượt là mẫu đối chứng không có IPTG và mẫu biểu hiện IPTG 0.3 mM, đường chạy 4; 5 lần lượt là cặn và dịch siêu âm phá vỡ tế bào, đường chạy 6: dịch qua cột sau khi ủ mẫu với nickel, đường chạy 7: dịch tinh sạch chứa protein Pwo-pol. b- Tối ưu quy trình tinh sạch hình a bằng cách tăng nồng độ imidazol trong đệm rửa, đường chạy 1: marker protein, đường chạy 2; 3; 4; tương ứng là đệm rửa 1 (30 mM imidazole), đệm rửa 2 (60 mM imidazole), đệm rửa 3 (100 mM imidazole), đường chạy 5: mẫu được tinh sạch sau khi sử dụng cả 3 loại đêm rửa. Các mẫu protein được điên di trên gel SDS-PAGE 10%, 120V, 90 phút.
Kết quả điện di quy trình tinh sạch sắc ký ái lực sử dụng máy siêu âm phá vỡ tế bào (hình 16a) chỉ ra mẫu sử dụng trong tinh sạch là mẫu biểu hiện IPTG 0.3 mM. Trong đó, băng protein biểu hiện có kích thước khoảng 92 kDa chỉ có ở mẫu biểu hiện khi so sánh với mẫu đối chứng. Thêm vào đó, lượng protein Pwo-pol vẫn còn nhiều trong cặn phá vỡ bằng máy siêu âm khi so sánh với dịch phá vỡ thu được. Do đó, cần tiếp tục tối ưu quá trình phá vỡ tế bào để hiệu suất protein tái tổ hợp thu được cao hơn. Dịch tinh sạch protein tái tổ hợp thu được có độ tinh sạch kém. Hầu hết các protein của E. coli vẫn chưa được loại bỏ, chỉ một lượng nhỏ protein không bám với nickel đã đi qua cột. Vì vậy, các protein tạp này có thể có khả năng liên kết với nickel nên cần tối ưu thêm bước rửa như tăng nồng độ imidazole trong đệm rửa.
Kết quả tối ưu bước rửa các protein tạp của E. coli trong phương pháp tinh sạch với cột sắc lý ái lực (hình 16b) không đạt hiệu quả như mong muốn. Khi tăng nồng độ imdazole trong dung dịch đệm rửa từ 30 mM lên 60mM và 100mM, lượng protein tái tổ hợp đã bị rửa trôi nhiều hơn. Trong khi đó, lượng protein tạp bị rửa trôi không đáng kể. Điều này chứng tỏ có khả năng các protein đã liên kết với nhau
và liên kết với protein tái tổ hợp. Vì vậy, chúng đã được giữ lại trên cột cùng với protein tái tổ hợp.
b. Sử dụng mẫu tế bào biểu hiện được phá vỡ bằng sóng siêu âm kết hợp xử lý ở nhiệt độ 70oC Mk 26 42 55 72 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 kDa 92 kDa
Hình 17: Tinh sạch sắc ký ái lực kết hợp xử lý ở nhiệt độ 70oC
Đường chạy 1: marker protein, đường chạy 2; 3 lần lượt là mẫu đối chứng không có IPTG và mẫu biểu hiện IPTG 0.3 mM, đường chạy 4; 6 lần lượt là cặn và dịch siêu âm phá vỡ tế bào xử lý với nhiệt độ 70oC, đường chạy 5; 7 lần lượt là cặn và dịch siêu âm phá vỡ tế bào, đường chạy 8: dịch qua cột sau khi ủ mẫu với nickel, đường chạy 9: dịch tinh sạch chứa protein Pwo-pol, đường chạy 10: rửa cột với nước. Các mẫu protein được điên di trên gel SDS-PAGE 10%, 120V, 90 phút.
Kết quả điện di mẫu tinh sạch protein Pwo-pol bằng phương pháp sắc ký ái lực kết hợp ủ hỗn hợp siêu âm ở 70oC/1h vẫn chưa loại bỏ được các protein không mong muốn. Kết quả cho thấy, lượng protein Pwo-pol còn lại ở cặn phá vỡ ở 70oC ít hơn ở cặn siêu âm và dịch phá vỡ ở 70oC lại chứa nhiều hơn ở dịch siêu âm. Do đó, khả năng ly giải tế bào giải phóng protein tái tổ hợp ở 70oC là hiệu quả hơn so với chỉ siêu âm phá vỡ tế bào. Thêm vào đó, lượng protein tạp trong dịch đun nóng 70oC lại được giảm đi so với trong dịch siêu âm. Kết quả này chứng tỏ việc đun nóng đã giúp loại bỏ được protein tạp. Tuy nhiên, mức độ tinh sạch protein Pwo-pol vẫn chưa được cải thiện so với quy trình tiến hành trước đó.
c. Sử dụng mẫu tế bào biểu hiện được phá vỡ bằng sóng siêu âm kết hợp xử lý ở nhiệt độ 95oC
Mk 1 2 3 4 5 6 7 8 26 42 55 72 kDa 92 kDa
Hình 18: Tinh sạch sắc ký ái lực kết hợp xử lý ở nhiệt độ 95oC