3.5.1. Tối ưu thành phần buffer PCR
95oC No heat 70oC
Mk No heat 70oC 95oC No heat 70oC 95oC
10X buffer 7.5 10X buffer 8.0 10X buffer 8.8
300bp 500bp 100bp 400bp 2 kb 3 kb 1 kb 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 > 2 kb
Hình 20: Ảnh hưởng của pH đến sự ổn định của buffer PCR
Hàng trên: Sản phẩm nhân gen kích thước nhỏ của các protein Pwo-pol tái tổ hợp từ phương pháp tinh sạch sắc ký ái lực. Hàng dưới: Sản phẩm nhân gen kích thước lớn của các protein Pwo-pol tái tổ hợp từ phương pháp tinh sạch sắc ký ái lực. Các protein theo thứ tự lần lượt là Pwo-pol tinh sạch sắc ký ái lực, Pwo-pol tinh sạch sắc ký ái lực sau khi xử lý ở nhiệt độ 70oC, Pwo-pol tinh sạch sắc ký ái lực sau khi xử lý ở nhiệt độ 95oC. Đường chay 1: marker iNtRon, đường chạy 2; 3; 4: phản ứng PCR với buffer pH 7.5, đường chạy 5; 6; 7: phản ứng PCR với buffer pH 8.0, đường chạy 8; 9; 10: phản ứng PCR với buffer pH 8.8. Kết quả điện di trên gel agrose 1%, 100V, 30 phút.
Theo các nghiên cứu trước đây, pH là một trong những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến khả năng hoạt động của mỗi loại enzyme DNA-pol. Thông thường các enzyme nhóm DNA-polB có hoạt động tốt trong dải pH từ 8.0 – 9.0 [22]. Do đó, chúng tôi đã thử hoạt tính của enzyme với 3 loại buffer PCR có pH lần lượt là 7.5; 8.0; và 8.8. Kết quả điện di sản phẩm PCR nhân gen AcrH như hình 20 cho thấy protein Pwo-pol tinh sạch bằng quy trình sắc ký ái lực chỉ có hoạt tính ở 10X buffer, pH 8.0. Trong khi đó, cả 2 protein Pwo-pol được tinh sạch bằng quy trình sắc ký ái lực đã xử lý với nhiệt độ cao lại có phản ứng ổn định ở cả 3 loại buffer với pH khác nhau. Do đó, có thể mức độ tinh sạch của protein tái tổ hợp đã ảnh hưởng đến hoạt tính của enzyme trong điều kiện pH chưa tối ưu
Chúng tôi tiếp tục so sánh kết quả điện di sản phẩm PCR có kích thước lớn hơn (> 2 kb), chỉ có protein Pwo-pol tinh sạch bằng quy trình sắc ký ái lực đã xử lý với nhiệt độ 95oC. Và protein này có độ tinh sạch tốt nhất nên đã cho hoạt tính ổn định nhất với cả kích thước nhỏ và kích thước lớn. Tuy nhiên băng chính của sản
phẩm PCR kích thước lớn nhân được không sáng rõ như sản phẩm PCR kích thước nhỏ mờ, và còn có thêm một số băng phụ. Vì vậy, chúng tôi tiếp tục tối ưu một yếu tố khác là nồng độ KCl cho buffer PCR với pH 8.8, ptrong điều kiện giảm nồng độ khuôn mẫu. Mk 100mM KCl 250mM KCl 400bp 400bp 1 2 3 4 5 6
Hình 21: Ảnh hưởng của nồng độ KCl đến khả năng khuếch đại đoạn gen ngắn Hàng trên: phản ứng PCR sử dụng buffer có nồng độ KCl là 100 mM, hàng dưới phản ứng PCR sử dụng buffer có nồng độ KCl là 250 mM. Các thành phần khác của buffer PCR bao gồm 200 mM Tris-HCl pH 8.8, 100 mM (NH4)2SO4, 20 mM MgSO4, 1% Triton X, 1 mg/ml BSA. Đường chạy 1: marker iNtRon, đường chạy 2; 3; 4; 5; 6 tương ứng với các nồng độ giảm dần của protein Pwo-pol tinh sạch theo phương pháp sắc ký ái lực sau khi xử lý với nhiệt độ 95oC từ 2 – 0.4 mg/ml. Kết quả điện di trên gel agarose 1%, 100V, 15 phút.
Muối KCl là thành phần quan trọng giúp ổn đinh DNA polymerase trong quá trình kéo dài, tuy nhiên chúng có thể làm giảm khả năng biến tính của DNA. Tăng nồng độ KCl giúp làm tăng lượng sản phẩm PCR cho kích thước đoạn gen ngắn khoảng 400 bp (hình 21). Kết quả này cũng đánh giá một phần ảnh hưởng của nồng độ protein thử hoạt tính đến độ sáng băng sản phẩm PCR. Với buffer PCR bao gồm 100 mM KCl, độ sáng băng giảm khi nồng độ enzyme dưới 0.8 mg/ml. Trong khi đó, với buffer bao gồm 250 mM KCl thu được kết quả các sản phẩm PCR có độ sáng tương đương nhau ở các nồng độ protein khác nhau. Điều này cho thấy KCl đã giúp làm tăng hoạt độ của protein Pwo-pol tái tổ hợp.
3.5.2. Hoạt tính sao chép
Bên cạnh việc so sánh nồng độ, độ tinh sạch của protein tái tổ hợp bằng điện di gel SDS-PAGE, cũng cần đảm bảo sau mỗi phương pháp tinh sạch thì protein tái
tổ hợp thu được có hoạt tính ổn định, không bị biến tính hay bị ảnh hưởng bởi các thành phần hóa chất từ phương pháp tinh sạch.
Mk 1kb i-Taq 0.5 ul Pwo (1) 0.5 ul i-Taq 0.2 ul Pwo (1) 0.2 ul 1kb 500bp 250bp 2kb 1 2 3 4 5
a- 100bpMk Pwo (1)0.5 ul Pwo (2)1 ul Pwo (2)1 ul Pwo (2)0.5 ul Pwo (2)0.25 ul
1 2 3 4 5 6 400bp b- 1kb 500bp 100bp
Hình 22: Hoạt tính sao chép của Pwo-pol tái tổ hợp sau tinh sạch
a. Phản ứng PCR cho protein Pwo-pol (1) tinh sạch theo phương pháp sắc ký ái lực, kết quả so sánh với enzyme thương mại i-Taq ở cùng điều kiện, đường chạy 1: marker 1kb iNtRon, đường chạy 2; 3; 5 phản ứng PCR với nhiệt độ biến tính 95oC, đường chạy 4: phản ứng PCR với nhiệt độ giai đoạn biến tính 98oC; b. Pwo-pol (2) tinh sạch theo phương pháp kết tủa 20% AS, kết quả so sánh với protein Pwo-pol (1) tinh sạch theo phương pháp sắc ký ái lực, ở cùng điều kiện, đường chạy 1: marker iNtRon, đường chạy 2; 3; 5 phản ứng PCR với nhiệt độ biến tính 95oC, đường chạy 4: phản ứng PCR với nhiệt độ giai đoạn biến tính 98oC. Kết quả điện di trên gel agarose 1%, 100V, 30 phút.
Protein Pwo-pol ban đầu thử nghiệm với phương pháp tinh sạch sắc ký ái lực đã có hoạt tính sao chép tương đương với enzyme i-Taq thương mại (hình 22a) khi nhân đúng băng có kích thước khoảng 400 bp của gen AcrH. Mặt khác khi sử dụng nhiệt độ trong giai đoạn biến tính 95oC, sản phẩm PCR của protein Pwo-pol (đường chạy 2) có vệt smear, nhiều dimer. Điều này có thể bị gây ra do protein chưa được tinh sạch tốt.
Mặc dù, cả hai protein Pwo-pol (1) tinh sạch theo phương pháp sắc ký ái lực và Pwo-pol (2) tinh sạch theo phương pháp kết tủa đều chưa đảm bảo về độ tinh sạch, tuy nhiên từ kết quả điện di sản phẩm PCR (hình 22b) cho thấy protein tinh sạch bằng cột sắc ký ái lực có hoạt tính tốt hơn (đường chạy 2) so với khi tinh sạch bằng muối (NH4)2SO4. Nguyên nhân của việc tinh sạch bằng kết tủa có hoạt tính kém có thể do nồng độ protein Pwo-pol thu được thấp. Mặt khác nồng độ muối cao gây kết tủa cũng làm giảm khả năng cuộn gập tự nhiên của protein.
Từ kết quả này, có thể kết luận rằng phương pháp tinh sạch protein Pwo-pol tái tổ hợp bằng cột sắc ký ái lực cho hoạt tính sao chép tốt hơn phương pháp tinh sạch bằng kết tủa muối AS (20% bão hòa). Tiếp tục thử kiểm tra hoạt tính của protein ở nhiệt độ biến tính cao hơn 95oC.
3.5.3. Khả năng chịu nhiệt độ cao Mk Mk 100bp Pwo (1) 1:2 Pwo (1) 1:1 i-Taq 1:1 PhuMCB 0.4 ul Pwo (1) 1:4 i-Taq 1:8 Pwo (1) 1:8 1kb 500bp 100bp 400bp 1 2 3 4 5 6 7 8
Hình 23: Phản ứng của enzyme và protein tái tổ hợp ở nhiệt độ biến tính 98oC Đường chạy 1: marker iNtRon, đường chạy 2: enzyme PhusionMCB, đường chạy 3; 7: enzyme i-Taq pha loãng theo tỉ lệ lần lượt 1:1; 1:8, đường chạy 4; 5; 6; 8: protein Pwo-pol tinh sạch với phương pháp sắc ký ái lực kết hợp xử lý mẫu ở nhiệt độ 70oC pha loãng theo tỉ lệ lần lượt 1:1, 1:2, 1:4, 1:8 bằng buffer bảo quản. Kết quả điện di trên gel agarose 1%, 100V, 15 phút.
Protein Pwo-pol tái tổ hợp tinh sạch với phương pháp sắc ký ái lực sau khi ủ mẫu ở nhiệt độ 70oC có hoạt tính rất ổn định khi nhân đoạn gen AcrH (từ kết quả tối ưu buffer PCR). Thêm vào đó, nồng độ của protein cũng ảnh hưởng đến hoạt tính nhân gen của chúng. Vì vậy, chúng tôi đã tiến hành pha loãng protein Pwo-pol tái tổ hợp với buffer bảo quản theo các tỉ lệ lần lượt 1:1, 1:2, 1:4, 1:8. Như kết quả điện di (hình 23), cho thấy ở tỉ lệ pha loãng 1:8 lượng sản phẩm nhân gen đã giảm đi đáng kể so với các tỉ lệ khác. Chứng tỏ nồng độ protein Pwo-pol thu được là rất cao, mặc dù pha loãng 8 lần nhưng vẫn còn hoạt tính nhân gen.
Kết quả thử nghiệm các nồng độ trên là quan trọng để đánh giá khả năng chịu nhiệt độ cao lên đến 98oC của protein tái tổ hợp. Mẫu pha loãng 1:8 giảm hiệu suất không gây ra bởi biến tính ở nhiệt độ cao. Kết quả cũng được so sánh với 2 enzyme khác là PhusionMCB và i-Taq. Cả 2 mẫu có sử dụng thành phần enzyme i- Taq không có phản ứng khuếch đại. Kết quả này chứng minh protein Pwo-pol tái tổ hợp thu được có khả năng chịu nhiệt cao hơn so với Taq DNA polymerase theo đúng lý thuyết.
3.5.4. Hoạt tính khi có mặt chất ức chế
Một trong những yêu cầu với việc sản xuất các enzyme DNA polymerase hiện nay ngoài khả năng chịu nhiệt thì chúng phải đảm bảo hoạt tính ổn định ngay cả khi phản ứng có mặt chất ức chế. Vì vậy, chúng tôi đã sử dụng khuôn DNA
genome tách chiết từ mô động vật theo phương pháp tách chiết phenol-chloroform để kiểm tra hoạt tính cho protein Pwo-pol tái tổ hợp thu được.
Mk (-) (+) T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 Mk (-) (+) T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 750bp 750bp 500bp 800bp 300bp 500bp 800bp 300bp a- b- 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Hình 24: Hoạt tính của các proein Pwo-pol trong phản ứng sử dụng khuôn genome a. Protein Pwo-pol được tinh sạch theo phương pháp sắc ký ái lực kết hợp xử lý với nhiệt độ 70oC; b. Protein Pwo-pol được tinh sạch theo phương pháp sắc ký ái lực kết hợp xử lý với nhiệt độ 95oC. Đường chạy 1: marker iNtRon, đường chạy 2: đối chứng âm không bổ sung khuôn DNA, đường chạy 3: đối chứng dương được bổ sung khuôn DNA có chất lượng tốt, đường chạy 4 – 11: các mẫu genome tách chiết từ mẫu mô của dơi bảo quản bằng cồn trong thời gian dài. Kết quả điện di trên gel agarose 1%, 100V, 15 phút.
Kết quả điện di cho thấy một phần gen COI (~750 bp) đã được khuếch đại với protein Pwo-pol được tinh sạch theo phương pháp sắc ký ái lực kết hợp xử lý với nhiệt độ 95oC (hình 24a). Nếu ở hình a, sản phẩm khuếch đại được hầu như không thể nhìn rõ thì ở hình b đã xuất hiện băng đồng đều ở nhiều mẫu, các băng sáng rõ, đúng kích thước như đối chứng dương. Kết quả này chứng tỏ chúng tôi đã tối ưu được quy trình tinh sạch protein Pwo-pol tái tổ hợp có hoạt tính tốt, đảm bảo các hoạt tính vốn có của DNA polymerase bền nhiệt
Từ các kết quả thu được, chúng tôi cho rằng quy trình phá vỡ tế bào ở nhiệt độ 95oC/30’ kết hợp ly tâm ở nhiệt độ cao và tinh sạch bằng sắc ký ái lực nickel là một trong những phương pháp đơn giản để sản xuất protein Pwo-pol tái tổ hợp.
CHƯƠNG 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
Đề tài đã đạt được một số kết quả chính như sau:
1. Tối ưu được mã bộ ba của gen mã hóa protein Pwo DNA polymerase.
2. Nhân dòng thành công gen mã hóa Pwo DNA polymerase vào vector pET-M. 3. Biểu hiện được lượng lớn protein Pwo DNA polymerase tái tổ hợp ở vi khuẩn E. coli BL21 (DE3).
4. Tinh sạch được protein Pwo DNA polymerase tái tổ hợp có độ tinh sạch lên đến 95% khi áp dụng phương pháp đun nóng nhiệt độ cao kết hợp sắc ký ái lực đuôi 6xHis-tag.
5. Protein Pwo DNA polymerase tái tổ hợp thu được sau khi tinh sạch ở nhiệt độ cao có hoạt tính sao chép ổn định.
Kiến nghị
1. Kiểm tra mức độ nhiễm plasmid của protein Pwo DNA polymerase tái tổ hợp thu được sau khi tinh sạch.
2. Tối ưu quy trình xử lý DNA bằng enzyme cắt DNase I trước khi tinh sạch protein Pwo DNA polymerase tái tổ hợp
3. Kiểm tra độ chính xác của protein Pwo DNA polymerase tái tổ hợp sử dụng cặp mồi gây đột biến trực tiếp.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Abu Al-Soud W., Râdström P. (1998), "Capacity of nine thermostable DNA polymerases To mediate DNA amplification in the presence of PCR- inhibiting samples", Applied and environmental microbiology, 64, PP. 3748- 3753.
2. Albà M. M. (2001), "Replicative DNA polymerases", Genome Biology, 2, PP. reviews3002.1.
3. Asif A., Mohsin H., Tanvir R., Rehman Y. (2017), "Revisiting the Mechanisms Involved in Calcium Chloride Induced Bacterial Transformation", Frontiers in microbiology, 8, PP. 2169-2169.
4. Block H., Maertens B., Spriestersbach A., Brinker N., Kubicek J., Fabis R., Labahn J., Schäfer F. (2009), Chapter 27 Immobilized-Metal Affinity Chromatography (IMAC): A Review, Academic Press, Elsevier.
5. Chen C.-Y. (2014), "DNA polymerases drive DNA sequencing-by-synthesis technologies: both past and present", Frontiers in microbiology, 5, PP. 305- 305.
6. Dąbrowski S., Kur J. (1998), "Cloning and Expression in Escherichia coli of the Recombinant His-Tagged DNA Polymerases from Pyrococcus furiosus and Pyrococcus woesei", Protein Expression and Purification, 14, PP. 131-138. 7. Das-Bradoo S., Bielinsky A.-K. (2010), "DNA replication and checkpoint control
in S phase", Nature, 9, PP. 74-79.
8. DasSarma S., Coker J. A., DasSarma P. (2009), Archaea (overview), Academic Press, Oxford.
9. Dumon-Seignovert L., Cariot G., Vuillard L. (2004), "The toxicity of recombinant proteins in Escherichia coli: a comparison of overexpression in BL21(DE3), C41(DE3), and C43(DE3)", Protein Expression and Purification, 37, PP. 203-206.
10. Duong-Ly K. C., Gabelli S. B. (2014), Chapter Seven - Salting out of Proteins Using Ammonium Sulfate Precipitation, Academic Press, Elsevier.
11. Ecker D., Khan M. I., Marsh J., Butt T. R., Crooke S. T. (1987), "Chemical synthesis and expression of a cassette adapted ubiquitin gene", Journal of Biological Chemistry, 262, PP. 3524-3527.
12. Ghasemi A., Salmanian A. H., Sadeghifard N., Salarian A. A., Gholi M. K. (2011), "Cloning, expression and purification of Pwo polymerase from Pyrococcus woesei", Iranian journal of microbiology, 3, PP. 118-122.
13. Hayat S. M., Farahani N., Golichenari B., Sahebkar A. (2018), "Recombinant Protein Expression in Escherichia coli (E. coli): What We Need to Know",
Current pharmaceutical design, 24, PP. 718-725.
14. Henry I., Sharp P. M. (2006), "Predicting Gene Expression Level from Codon Usage Bias", Molecular Biology and Evolution, 24, PP. 10-12.
15. Heo J. H., Kim S. W. (2013), "Cloning the Pfu DNA polymerase from DNA contaminants in preparations of commercial Pfu DNA polymerase", African Journal of Microbiology Research, 7, PP. 745-750.
16. Hoseini S. S., Sauer M. G. (2015), "Molecular cloning using polymerase chain reaction, an educational guide for cellular engineering", Journal of biological engineering, 9, PP. 2-2.
17. Jia B., Jeon C. O. (2016), "High-throughput recombinant protein expression in Escherichia coli: current status and future perspectives", Open biology, 6, PP. 160196.
18. Kane J. F. (1995), "Effects of rare codon clusters on high-level expression of heterologous proteins in Escherichia coli", Current Opinion in Biotechnology, 6, PP. 494-500.
19. Kanoksilapatham W., González J. M., Maeder D. L., DiRuggiero J., Robb F. T. (2004), "A proposal to rename the hyperthermophile Pyrococcus woesei as Pyrococcus furiosus subsp. woesei", Archaea (Vancouver, B.C.), 1, PP. 277- 283.
20. Kary M., Faloona F., Scharf S., Saiki R., Horn G., Erlich H. (1992), "Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. 1986", Biotechnology (Reading, Mass.), 24, PP. 17-27.
21. Khosravinia H., Ramesha K. (2007), "Influence of EDTA and magnesium on DNA extraction from blood samples and specificity of polymerase chain reaction", African Journal of Biotechnology (ISSN: 1684-5315) Vol 6 Num 3,
6, PP. 184-187.
22. Killelea T., Ralec C., Bossé A., Henneke G. (2014), "PCR performance of a thermostable heterodimeric archaeal DNA polymerase", Frontiers in microbiology, 5, PP. 195-195.
23. Kim S. W., Kim D.-U., Kim J. K., Kang L.-W., Cho H.-S. (2008), "Crystal structure of Pfu, the high fidelity DNA polymerase from Pyrococcus furiosus", International journal of biological macromolecules, 42, PP. 356- 361.
24. Kimple M. E., Brill A. L., Pasker R. L. (2013), "Overview of affinity tags for protein purification", Current protocols in protein science, 73, PP. 9.9.1- 9.9.23.
25. Lehman I. (2003), "Discovery of DNA polymerase", The Journal of biological