Nghiên cứu sử dụng 2 loại môi trường (LB lỏng, LB agar) cho nuôi cấy vi khuẩn và một số dung dịch đệm, hóa chất stock được liệt kê trong bảng 5. Các hóa chất, dung dịch đệm được pha với các nồng độ stock (50X, 10X…) trước khi đem sử dụng làm thành phần cho đệm điện di DNA, điện di protein, tinh sạch protein…
Hóa chất để pha các dung dịch đệm được mua từ các hãng uy tín như Merck, Thermo Scientific, Sigma. Bên cạnh đó, nghiên cứu cũng sử dụng một số bộ kit thương mại như kít tách chiết plasmid (Thermo Scientific), kít tinh sạch/thôi gel sản phẩm PCR và sản phẩm cắt, nối DNA/plasmid (iNtRon).
Bảng 5: Dung dịch đệm, hóa chất pha stock
Loại dung dịch Tên hóa chất Nồng độ Thành phần Khối lượng (thể tích)
Môi trường (1L) LB lỏng Tryptone 10 g
(bảo quản 4oC) NaCl 10 g
Yeast extract 5 g
LB agar LB lỏng 1L
Agar 15 g
Đệm Stock (1L) Tris HCl 1 M Tris base 121.1 g (bảo quản 4oC) pH 6.8 HCl (đặc) 80-85 ml pH 8.0 40-42 ml pH 8.8 32-35 ml EDTA, pH 8.0 0.5 M EDTA 148 g NAOH 30-40g SDS, pH 6.6 10% SDS 100 g APS 10% APS 100 g Acrylamide/Bis 30% Acrylamide 300g Bis-acrylamide 8 g (100 ml) NiCl2 50 mM 1.296 g NaCl 5 M 292.2 g KCl 1 M 74.55 g (NH4)2SO4 1 M 132.14 g MgSO4 1 M 120.37 g BPB 0.2% 0.2 g (-20oC) 100 ml IPTG 1M 238 g Imidazole 1M 6.8 g DTT 1M 154.5 g BSA 100 mg/ml 10 g Ampicilin 100 mg/ml 10 g a. Đệm điện di DNA
Đệm TAE, stock 50X (2 M Tris, 50 mM EDTA) là đệm chạy điên di gel agarose.
Trong 1 lít bao gồm 242 g tris base; 57.1 ml acetic acid (đặc) và 100 ml EDTA 0.5 M, pH 8.0, lưu ý ban đầu chỉ đổ vào khoảng 800ml nước cất để hòa tan các hóa chất trước khi thêm nước cho đủ 1 lít vì các hóa chất có khối lượng lớn cũng chiếm một lượng thể tích nhất định.
DNA loading dye (5X) tra mẫu DNA bao gồm 25% Glycerol, 25 mM EDTA, 0.5%
b. Đệm điện di protein
Đệm Running 1X (25 mM Tris, 192 mM glycine, 0.1% SDS, pH8.3) là dung dịch
đệm chạy điên di gel SDS-PAGE. Trong 1 lít running buffer 1X bao gồm 30.3 g tris base, 144 g glycine, 10 g SDS. Tương tự pha đệm TAE, dùng khoảng 800 ml nước cất hòa tan các hóa chất trước khi thêm nước vào để được 1 lít dung dịch.
SDS loading dye (5X) tra mẫu protein bao gồm 250mM Tris, pH 6.8, 10% (g/ml)
SDS, 30% Glycerol, 5% β-mercapitalethanol, 0.02% BPB, sau khi pha hỗn hợp có màu xanh lục đậm, có thể thay đổi tùy thuộc vào pH của dung dịch.
Đệm nhuộm gel SDS-PAGE gồm có 0.1% (g/ml) Coomassie Brilliant Blue G-250
và 50% methanol, 10% acetic acid tổng thể tích dung dịch đệm.
Đệm tẩy gel SDS-PAGE gồm có 40% methanol, 10% acetic acid tổng thể tích dung
dịch đệm.
c. Đệm tinh sạch và xử lý cột tinh sạch
Các dung dịch đệm sử dụng trong quá trình tinh sạch protein bằng cột sắc ký ái lực nickel-resin:
Đệm A1 bao gồm 50mM Tris-HCl, pH 8.0, 300mM NaCl, 5mM Imidazole Đệm B1 bao gồm 50mM Tris-HCl, pH 8.0, 300mM NaCl, 30mM Imidazole Đệm C1 bao gồm 50mM Tris-HCl, pH 8.0, 300mM NaCl, 500mM Imidazole
Đối với phương pháp tinh sạch protein bằng phương pháp kết tủa (NH4)2SO4
sử dụng 2 dung dịch đệm:
Đệm A2 bao gồm 50mM Tris-HCl, pH 8.0, 1mM EDTA Đệm B2 bao gồm 50mM Tris HCl, 20% sucrose, 1mM EDTA Đệm C2 bao gồm 50mM Tris HCl, 300mM NaCl
Đệm thẩm tách cho cả hai phương pháp bao gồm các thành phần: 20mM Tris-HCl,
pH 8.0, 200mM NaCl