Dưới đây là kết quả so sánh sự phá vỡ tế bào khi có sự kết hợp phương pháp siêu âm với nhiệt độ cao. Bước đầu đánh giá khả năng tinh sạch của các phương pháp khác nhau. Mk 26 42 55 72 1 2 3 4 5 6 kDa 92 kDa
Hình 15: So sánh sự phá vỡ tế bào với nhiệt độ cao
Mẫu vi khuẩn biểu hiện ở nồng độ IPTG 0.3 mM/16h được siêu âm phá vỡ tế bào, sau đó xử lý nhiệt tương ứng. Ở đường chạy 1: marker protein, đường chạy 2: dịch siêu âm sau khi ly tâm, không xử lý nhiệt, đường chạy số 3; 4 cặn phá vỡ tế bào thu được sau khi siêu âm kết hợp xử lý với nhiệt độ lần lượt 70oC và 95oC, đường chạy số 5; 6 dịch phá vỡ tế bào sau khi siêu âm kết hợp xử lý nhiệt độ lần lượt 70oC và 95oC. Các mẫu protein được điên di trên gel SDS-PAGE 10%, 120V, 90 phút.
Pwo-pol có nguồn gốc từ vi khuẩn Cổ ưa nhiệt, độ bền ít nhất là 2h ở 100oC. Do đó, chúng tôi tiến hành xử lý tế bào ở nhiệt độ cao khoảng từ 70-95oC trước khi tinh sạch. Kết quả được so sánh với mẫu tế bào không xử lý nhiệt (mẫu tế bào siêu âm trên đá lạnh). Tuy nhiên, khi thử mẫu với nhiệt độ cao trong thời gian dài có thể làm giảm hoạt tính của protein thu được sau tinh sạch [15]. Nên chúng tôi đã thực hiện xử lý tế bào với nhiệt độ 70oC tối đa 1h ủ mẫu liên tục, còn với nhiệt độ 95oC tối đa là 30 phút liên tục. Kết quả đáng chú ý, mức độ loại bỏ các protein của E. coli
trong dịch phá vỡ tế bào biểu hiện tăng dần theo nhiệt độ: trên đá lạnh < 70oC < 95oC. Từ kết quả này, tiếp tục tối ưu phương pháp tinh sạch với cột sắc ký ái lực nilel để loại bỏ những protein không có gắn đuôi 6xHis-tag.
a. Sử dụng mẫu tế bào biểu hiện được phá vỡ bằng sóng siêu âm
Trong quy trình này, chúng tôi tiến hành tất cả các thao tác trên đá lạnh, đảm bảo protein không bị biến tính, hay ảnh hưởng khác bởi nhiệt độ.
26 42 55 72 Mk 1 2 3 4 5 6 7 kDa 72 55 42 26 Mk 5 4 3 2 1 kDa 92 kDa a- b-
Hình 16: Mẫu siêu âm phá vỡ tế bào tinh sạch sắc ký ái lực
a- Quy trình tinh sạch sắc ký ái lực sử dụng máy siêu âm phá vỡ tế bào, đường chạy 1: marker protein, đường chạy 2; 3 lần lượt là mẫu đối chứng không có IPTG và mẫu biểu hiện IPTG 0.3 mM, đường chạy 4; 5 lần lượt là cặn và dịch siêu âm phá vỡ tế bào, đường chạy 6: dịch qua cột sau khi ủ mẫu với nickel, đường chạy 7: dịch tinh sạch chứa protein Pwo-pol. b- Tối ưu quy trình tinh sạch hình a bằng cách tăng nồng độ imidazol trong đệm rửa, đường chạy 1: marker protein, đường chạy 2; 3; 4; tương ứng là đệm rửa 1 (30 mM imidazole), đệm rửa 2 (60 mM imidazole), đệm rửa 3 (100 mM imidazole), đường chạy 5: mẫu được tinh sạch sau khi sử dụng cả 3 loại đêm rửa. Các mẫu protein được điên di trên gel SDS-PAGE 10%, 120V, 90 phút.
Kết quả điện di quy trình tinh sạch sắc ký ái lực sử dụng máy siêu âm phá vỡ tế bào (hình 16a) chỉ ra mẫu sử dụng trong tinh sạch là mẫu biểu hiện IPTG 0.3 mM. Trong đó, băng protein biểu hiện có kích thước khoảng 92 kDa chỉ có ở mẫu biểu hiện khi so sánh với mẫu đối chứng. Thêm vào đó, lượng protein Pwo-pol vẫn còn nhiều trong cặn phá vỡ bằng máy siêu âm khi so sánh với dịch phá vỡ thu được. Do đó, cần tiếp tục tối ưu quá trình phá vỡ tế bào để hiệu suất protein tái tổ hợp thu được cao hơn. Dịch tinh sạch protein tái tổ hợp thu được có độ tinh sạch kém. Hầu hết các protein của E. coli vẫn chưa được loại bỏ, chỉ một lượng nhỏ protein không bám với nickel đã đi qua cột. Vì vậy, các protein tạp này có thể có khả năng liên kết với nickel nên cần tối ưu thêm bước rửa như tăng nồng độ imidazole trong đệm rửa.
Kết quả tối ưu bước rửa các protein tạp của E. coli trong phương pháp tinh sạch với cột sắc lý ái lực (hình 16b) không đạt hiệu quả như mong muốn. Khi tăng nồng độ imdazole trong dung dịch đệm rửa từ 30 mM lên 60mM và 100mM, lượng protein tái tổ hợp đã bị rửa trôi nhiều hơn. Trong khi đó, lượng protein tạp bị rửa trôi không đáng kể. Điều này chứng tỏ có khả năng các protein đã liên kết với nhau
và liên kết với protein tái tổ hợp. Vì vậy, chúng đã được giữ lại trên cột cùng với protein tái tổ hợp.
b. Sử dụng mẫu tế bào biểu hiện được phá vỡ bằng sóng siêu âm kết hợp xử lý ở nhiệt độ 70oC Mk 26 42 55 72 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 kDa 92 kDa
Hình 17: Tinh sạch sắc ký ái lực kết hợp xử lý ở nhiệt độ 70oC
Đường chạy 1: marker protein, đường chạy 2; 3 lần lượt là mẫu đối chứng không có IPTG và mẫu biểu hiện IPTG 0.3 mM, đường chạy 4; 6 lần lượt là cặn và dịch siêu âm phá vỡ tế bào xử lý với nhiệt độ 70oC, đường chạy 5; 7 lần lượt là cặn và dịch siêu âm phá vỡ tế bào, đường chạy 8: dịch qua cột sau khi ủ mẫu với nickel, đường chạy 9: dịch tinh sạch chứa protein Pwo-pol, đường chạy 10: rửa cột với nước. Các mẫu protein được điên di trên gel SDS-PAGE 10%, 120V, 90 phút.
Kết quả điện di mẫu tinh sạch protein Pwo-pol bằng phương pháp sắc ký ái lực kết hợp ủ hỗn hợp siêu âm ở 70oC/1h vẫn chưa loại bỏ được các protein không mong muốn. Kết quả cho thấy, lượng protein Pwo-pol còn lại ở cặn phá vỡ ở 70oC ít hơn ở cặn siêu âm và dịch phá vỡ ở 70oC lại chứa nhiều hơn ở dịch siêu âm. Do đó, khả năng ly giải tế bào giải phóng protein tái tổ hợp ở 70oC là hiệu quả hơn so với chỉ siêu âm phá vỡ tế bào. Thêm vào đó, lượng protein tạp trong dịch đun nóng 70oC lại được giảm đi so với trong dịch siêu âm. Kết quả này chứng tỏ việc đun nóng đã giúp loại bỏ được protein tạp. Tuy nhiên, mức độ tinh sạch protein Pwo-pol vẫn chưa được cải thiện so với quy trình tiến hành trước đó.
c. Sử dụng mẫu tế bào biểu hiện được phá vỡ bằng sóng siêu âm kết hợp xử lý ở nhiệt độ 95oC
Mk 1 2 3 4 5 6 7 8 26 42 55 72 kDa 92 kDa
Hình 18: Tinh sạch sắc ký ái lực kết hợp xử lý ở nhiệt độ 95oC
Đường chạy 1: marker protein, đường chạy 2; 3 lần lượt là mẫu đối chứng không có IPTG và mẫu biểu hiện IPTG 0.3 mM, đường chạy 4; 5 lần lượt là cặn và dịch siêu âm phá vỡ tế bào xử lý với nhiệt độ 95oC, đường chạy 6: dịch qua cột sau khi ủ mẫu với nickel, đường chạy 7: dịch tinh sạch chứa protein Pwo-pol, đường chạy 8: rửa cột với nước. Các mẫu protein được điên di trên gel SDS-PAGE 10%, 120V, 90 phút.
Quá trình xử lý mẫu với nhiệt độ cao lên đến 95% đã mang lại hiệu quả khi loại bỏ phần lớn protein tạp của vi khuẩn E. coli. Như kết quả điện di hình 18, phần lớn protein Pwo-pol đã nằm trong pha dịch. Độ tinh sạch của mẫu protein thu được khá cao, hiệu suất thu hồi protein tái tổ hợp đạt trên 50%. Bên cạnh đó, tế bào biểu hiện khi được xử lý với nhiệt độ cao 95oC trong thời gian 30 phút cũng dễ dàng giải phóng protein Pwo-pol mà không cần tiến hành bước siêu âm phá vỡ tế bào. Đây là một trong những điều kiện giúp có thể tinh sạch protein Pwo-pol tái tổ hợp nhanh chóng và dễ dàng hơn.
Mặc dù đã tiến hành đun nóng tế bào ở nhiệt độ 95oC liên tục trong 30 phút nhưng vẫn không thể loại bỏ hoàn toàn các protein tạp khác. Vấn đề tồn tại này trong quá trình tinh sạch protein DNA polymerase được cho là có sự tương tác giữa các protein tham gia vào bộ máy sao chép DNA cũng như sự liên kết giữa chúng với các protein khác [27]. Do đó, khi protein Pwo-pol được giữ lại trên cột thì các protein này cũng được giữ lại. Vì vậy, cách giải quyết có thể sử dụng một số muối có khả năng gây biến tính tạm thời cho protein, làm giảm khả năng liên kết giữa chúng. Một số nghiên cứu trước đây đã sử dụng muối ammonium sulfate (AS) để tinh sạch với Taq-pol hoặc Pfu-pol và thu được những kết quả tốt.