Bên cạnh việc so sánh nồng độ, độ tinh sạch của protein tái tổ hợp bằng điện di gel SDS-PAGE, cũng cần đảm bảo sau mỗi phương pháp tinh sạch thì protein tái
tổ hợp thu được có hoạt tính ổn định, không bị biến tính hay bị ảnh hưởng bởi các thành phần hóa chất từ phương pháp tinh sạch.
Mk 1kb i-Taq 0.5 ul Pwo (1) 0.5 ul i-Taq 0.2 ul Pwo (1) 0.2 ul 1kb 500bp 250bp 2kb 1 2 3 4 5
a- 100bpMk Pwo (1)0.5 ul Pwo (2)1 ul Pwo (2)1 ul Pwo (2)0.5 ul Pwo (2)0.25 ul
1 2 3 4 5 6 400bp b- 1kb 500bp 100bp
Hình 22: Hoạt tính sao chép của Pwo-pol tái tổ hợp sau tinh sạch
a. Phản ứng PCR cho protein Pwo-pol (1) tinh sạch theo phương pháp sắc ký ái lực, kết quả so sánh với enzyme thương mại i-Taq ở cùng điều kiện, đường chạy 1: marker 1kb iNtRon, đường chạy 2; 3; 5 phản ứng PCR với nhiệt độ biến tính 95oC, đường chạy 4: phản ứng PCR với nhiệt độ giai đoạn biến tính 98oC; b. Pwo-pol (2) tinh sạch theo phương pháp kết tủa 20% AS, kết quả so sánh với protein Pwo-pol (1) tinh sạch theo phương pháp sắc ký ái lực, ở cùng điều kiện, đường chạy 1: marker iNtRon, đường chạy 2; 3; 5 phản ứng PCR với nhiệt độ biến tính 95oC, đường chạy 4: phản ứng PCR với nhiệt độ giai đoạn biến tính 98oC. Kết quả điện di trên gel agarose 1%, 100V, 30 phút.
Protein Pwo-pol ban đầu thử nghiệm với phương pháp tinh sạch sắc ký ái lực đã có hoạt tính sao chép tương đương với enzyme i-Taq thương mại (hình 22a) khi nhân đúng băng có kích thước khoảng 400 bp của gen AcrH. Mặt khác khi sử dụng nhiệt độ trong giai đoạn biến tính 95oC, sản phẩm PCR của protein Pwo-pol (đường chạy 2) có vệt smear, nhiều dimer. Điều này có thể bị gây ra do protein chưa được tinh sạch tốt.
Mặc dù, cả hai protein Pwo-pol (1) tinh sạch theo phương pháp sắc ký ái lực và Pwo-pol (2) tinh sạch theo phương pháp kết tủa đều chưa đảm bảo về độ tinh sạch, tuy nhiên từ kết quả điện di sản phẩm PCR (hình 22b) cho thấy protein tinh sạch bằng cột sắc ký ái lực có hoạt tính tốt hơn (đường chạy 2) so với khi tinh sạch bằng muối (NH4)2SO4. Nguyên nhân của việc tinh sạch bằng kết tủa có hoạt tính kém có thể do nồng độ protein Pwo-pol thu được thấp. Mặt khác nồng độ muối cao gây kết tủa cũng làm giảm khả năng cuộn gập tự nhiên của protein.
Từ kết quả này, có thể kết luận rằng phương pháp tinh sạch protein Pwo-pol tái tổ hợp bằng cột sắc ký ái lực cho hoạt tính sao chép tốt hơn phương pháp tinh sạch bằng kết tủa muối AS (20% bão hòa). Tiếp tục thử kiểm tra hoạt tính của protein ở nhiệt độ biến tính cao hơn 95oC.