a- 1kb Mk 1Kb Clone 1 Clone 2 Clone 3 2599 bp 266 bp 1 2 3 4 2kb 250bp 3kb b-
Hình 11: Biến nạp, nuôi cấy, chọn lọc plasmid tái tổ hợp pEtM-Pwo
a- Tế bào khả biến E. coli BL21 (DE3) bổ sung plasmid tái tổ hợp pEtM-Pwo cấy trải trên đĩa thạch bổ sung ampicilin. b- Kết quả điện di trên gel agarose 1% sản phẩm PCR chọn lọc khuẩn lạc chứa plasmid tái tổ hợp pEtM-Pwo, marker 1kb của hãng iNtRon (đường chạy 1) được sử dụng để so sánh kích thước của đoạn gen khuếch đại bằng cặp mồi T7 từ 3 khuẩn lạc tương ứng (đường chạy 2; 3; 4).
Đĩa thạch nuôi cấy tế bào khả biến có xuất hiện nhiều khuẩn lạc mọc cách đều nhau như hình 11a. Như vậy, đã biến nạp thành công hỗn hợp plasmid tái tổ hợp vào vi khuẩn E. coli. Kết quả biến nạp là đáng tin cậy khi đã được so sánh với đĩa đối chứng không bổ sung hỗn hợp plasmid tái tổ hợp, không quan sát thấy khuẩn lạc mọc trên đĩa thạch. Như vậy tế bào khả biến sử dụng trong quá trình biến nạp không bị nhiễm gen hoặc plasmid kháng kháng sinh.
Tuy nhiên khuẩn lạc mọc trên đĩa nuôi cấy bổ sung kháng sinh ampicilin (10 µg/ml) có thể xảy ra 2 trường hợp: (1) chứa plasmid tái tổ hợp hoặc (2) chứa plasmid chưa cắt hoàn toàn từ hỗn hợp sản phẩm cắt và nối enzyme giới hạn ở trên. Do đó, tiến hành chọn lựa 3 khuẩn lạc từ đĩa nuôi cấy, các khuẩn lạc mọc riêng rẽ, to, tròn đều sẽ được đem PCR kiểm tra hiệu suất chèn gen của phản ứng cắt nối.
Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra khuẩn lạc được chọn cho thấy, khuẩn lạc số 2 và 3 có mang plasmid tái tổ hợp được chèn thành công đoạn gen mã hóa Pwo-pol (hình 11b). Sản phẩm PCR từ hai khuẩn lạc này xuất hiện các băng có
với lý thuyết đoạn gen đích được nhân lên từ cặp mồi T7 cho kích thước là 2599 bp. Trong khi đó, khuẩn lạc số 1 mang plamid chưa chèn thành công đoạn gen đích, với cặp mồi T7 chỉ nhân lên sản phẩm PCR với kích thước khoảng hơn 250 bp.