Các vector chỉ thực hiện được chức năng của mình khi chúng có một số đặc tính như: có khả năng tự sao chép độc lập và tích cực trong tế bào vật chủ; có kích thước nhỏ, dễ chèn gen mục tiêu, dễ xâm nhập và được sao chép; mang một số dấu hiệu chọn lọc giúp phân biệt các tế bào mang plasmid tái tổ hợp với các tế bào không có plasmid tái tổ hợp; tồn tại bền vững trong tế bào vật chủ. Các đặc tính này là cơ sở quyết định các thành phần chính của plasmid với: gen quan tâm được gắn thêm đoạn khởi động và đoạn kết thúc; gen chỉ thị chọn lọc; các thành phần khác như vùng khởi đầu sao chép và vùng trình tự nhân dòng đa điểm cắt (Multi cloning site - MCS). Và cũng như các vector chuyển gen khác, vector pBI121 dùng trong nghiên cứu có kích thước khoảng 13 kb với các thành phần chính như sau:
(1). Đoạn khởi động gen (promoter)
Các gen ngoại lai có thể được biểu hiện thành protein cần phải có mặt các tín hiệu điều khiển thích hợp ở những vị trí thích hợp tương ứng. Những tín hiệu không thể thiếu trong quá trình biểu hiện gen bao gồm đoạn khởi động gen và đoạn kết thúc gen. Đoạn khởi động bao gồm trình tự nucleotide phía đầu 5’ của các gen cấu trúc. Nó đóng vai trò điều khiển quá trình phiên mã nhờ khả năng đảm bảo các vị trí nhận biết cho RNA polymerase, các yếu tố hoạt hóa và khởi động. Trong thực tế, phần lớn promoter 35S từ virus khảm hoa súp lơ (Cauliflower Mosaic virus 35S promoter, viết tắt CaMV 35S) được sử dụng cho sự biểu hiện của gen biến nạp ở tất cả các loại mô và tế bào. Promoter 35S có kích thước 835bp gồm 3 thành phần như sau:
-Hộp TATA ở vị trí từ -46 đến +8.
-Vùng tăng cường A (enhancer) từ vị trí –90 đến -46, làm tăng biểu hiện gen ngoại lai ở rễ.
- Vùng tăng cường B (enhancer) từ vị trí -343 đến -90, làm tăng biểu hiện gen ngoại lai ở lá.
(2). Vùng khởi động sao chép DNA (DNA-ori).
Các kĩ thuật di truyền liên quan rất nhiều đến E. coli mà Ti-plasmid thiếu điểm khởi đầu sao chép trong E. coli. Do đó, cần thiết kế thêm điểm khởi đầu sao chép để Ti-plasmid vừa có thể tự sao chép trong E. coli và A. tumefaciens.
+ Vùng pUC ori khởi động sao chép trong E. coli có nguồn gốc từ vector pUC19.
+ Vùng pRK2 oriV khởi động sao chép trong A. tumefaciens có nguồn gốc từ plasmid pRK2.
(3). Vùng cắt nối đa vị trí (Multi cloning site – MCS).
Trong vùng này chứa trình tự điểm cắt của một số enzyme giới hạn như:
HindIII, SmaI, BamHI, SacI, XbaI, SphI, PstI, EcoRV,… Trong đó, trình tự cắt của hai loại enzyme SacI và XbaI được thiết kế ở hai đầu ở gen GS1 được quan tâm sử dụng trong nội dung nghiên cứu này. Vì vậy, khi cắt vector pBI121 bằng hai loại enzyme trên chúng ta sẽ thu được hai băng có kích thước tương ứng là 11,2 kb (vector pBI121 loại gen GS1) và 1,8 kb (gen GS1).
(4). Vùng kết thúc (terminator).
Vùng kết thúc (vùng 3’) của các gen có các trình tự đặc trưng riêng. Vùng 3’ bao gồm các trình tự cho phép RNA polymerase nhận biết dấu hiệu ngừng phiên mã, và các trình tự kết thúc một gen để phân biệt gen này với gen khác. Các đoạn kết thúc thường có đuôi poly A như: AATTAA hoặc AACCAA.
(5) Gen chỉ thị.
Các gen chỉ thị trong chuyển gen thực vật thường có nguồn gốc từ vi khuẩn hoặc thực vật, gồm 2 loại như sau:
+ Gen chỉ thị chọn lọc (selectable marker gene): Các gen có nguồn gốc từ plasmid của vi khuẩn, gen mã hóa cho các enzyme phân hủy kháng sinh hoặc
các chất chọn lọc đặc hiệu. Ở vector pBI121 chứa gen nptII (neomycin phosphotransferase gene) được điều khiển bởi đoạn khởi động NOS promoter, do đó, chỉ có những thể biến nạp gen mới sống được trên môi trường có bổ sung thêm kháng sinh kanamycin. Việc sử dụng gen chỉ thị cần có một số yêu cầu: chất chọn lọc ức chế sinh trưởng của các tế bào không được biến nạp, đồng thời sự biểu hiện của gen chọn lọc không làm ảnh hưởng tới trao đổi chất của các tế bào chuyển nạp gen.
+ Gen chỉ thị sàng lọc (screenable marker gene hoặc reporter gene): gen chỉ thị sàng lọc cần có một số đặc điểm như: sản phẩm chỉ thị là duy nhất và không độc với tế bào thực vật, các enzyme chỉ thị phải có khả năng dịch mã ổn định cao, phương pháp phân tích thuận tiện, rẻ tiền, độ nhạy cao và có khả năng phản ứng với các polypeptide ngoài mà không ảnh hưởng hoạt tính enzyme. Ví dụ, gen gus mã hóa cho -glucuronidase cho phép sàng lọc hoạt tính enzyme dễ dàng trên cơ sở kĩ thuật nhuộm tế bào với dung dịch X-gluc. Tế bào, mô chuyển gen sẽ có màu xanh đặc trưng.
Hình 1.3. Sơ đồ thiết kế cấu trúc đoạn T-DNA của vector chuyển gen pBI121-GS1.