1.5.2.1. Phân tích sự có mặt của gen ngoại lai trong cây chuyển gen
Trên nguyên tắc gen ngoại lai khi được biến nạp vào tế bào có thể tồn tại trong tế bào chủ ở 3 trạng thái: (1) Tạm thời ở dạng DNA tự do; (2) Lâu dài dưới dạng một thể plasmid độc lập tự nhân và (3) Ổn định như một đoạn DNA của genome trong tế bào chủ và được nhân lên theo dạng tương hợp hay không tương hợp. Đây là trạng thái mong muốn nhất khi tạo cây chuyển gen vì tính bền vững của thể biến nạp, nhưng nó hoàn toàn phụ thuộc vào quá trình tái tổ hợp. Hầu hết các nghiên cứu biến nạp gen thuộc nhân vẫn có thể phát hiện thấy hiện tượng nhân không tương hợp đối với gen lạ khi hòa đồng vào DNA nhân do vị trí đoạn
gen lạ được ghép nối ảnh hưởng đến biểu hiện của chính nó hay gen chủ gần đó. Chính vì thế, các phương pháp sinh học phân tử nhằm xác định sự có mặt của gen và biểu hiện của gen đó trong tế bào là bước làm rất cần thiết.
Phân tích cây chuyển gen bằng kỹ thuật PCR
PCR (Polymerase chain reaction) được Kary B Mullis phát hiện ra năm 1983. Đây là phương pháp trong ống nghiệm để tổng hợp các trình tự DNA đặc hiệu nhờ enzyme, sử dụng hai mồi oligonucleotide để khuếch đại vùng DNA quan tâm nằm giữa hai mồi bằng cách lặp lại nhiều chu kỳ với các bước biến tính 2 mạch DNA khuôn, bắt cặp các mồi và kéo dài các sợi. Kỹ thuật PCR đơn giản dễ thực hiện với hầu hết các phòng thí nghiệm được trang bị máy PCR. Trong phân tích cây chuyển gen, gen chuyển đã được biết trình tự vì vậy chỉ cần sử dụng cặp mồi đặc hiệu cho gen đó và tách chiết DNA từ mẫu thực vật cần xác định làm khuôn là có thể tiến hành PCR. Sử dụng plasmid mang gen chuyển làm đối chứng, nếu sản phẩm PCR khi điện di có kích thước đúng như dự kiến và bằng với đối chứng thì mẫu phân tích được coi là dương tính. Tuy nhiên, PCR dương tính không đồng nghĩa với chuyển gen thành công vì có nhiều cách để giải thích sự có mặt của DNA trong mẫu phân tích: (1) Vi khuẩn A. tumefaciens mang gen chuyển có thể còn tồn tại trong khối mô hay trong các gian bào của mẫu phân tích. Hiện tượng này xuất hiện ở nhiều loại đối tượng và được gọi là dương tính giả. Nếu mẫu phân tích của thực vật đã qua nhân giống hữu tính tức đã qua một vài thế hệ thì hiện tượng này được loại trừ; (2) Gen chuyển tồn tại tự do trong tế bào chất (có thể biến mất qua sinh sản hữu tính); (3) Gen chuyển không hoạt động, tức không được phiên mã và biểu hiện ra protein có chức năng sinh học. Chính vì những lý do trên mà kết quả PCR mới chỉ có giá trị định hướng ban đầu khi phân tích cây chuyển gen. Tuy nhiên, kỹ thuật PCR lại tỏ ra hữu dụng đối với việc phân tích phát hiện các mẫu lương thực phực phẩm biến đổi gen (Genetic modify origanism-GMO). Để phục vụ việc xác định GMO, PCR còn được phát triển còn thành kỹ thuật multiplex PCR (MPCR) (Matsuoka và cs, 2001). Với việc sử dụng đồng thời nhiều cặp mồi nhận biết các gen khác nhau (promoter,
terminator, gen chọn lọc, gen đích…) trong một phản ứng, MPCR cho phép phát hiện đồng thời nhiều trình tự đích nếu mẫu có mang các gen đó. Thông thường các cặp mồi được sử dụng trong multiplex PCR là mồi P-35S, T-Nos, nptII. Nếu kết quả dương tính với bất cứ cặp mồi nào thì mẫu cần xác định rất có thể đã được chuyển gen.
Phân tích số bản copy của gen ngoại lai trong cây chuyển gen
Lai Southern để xác định số copy trong cây chuyển gen là phương pháp tin cậy và thông dụng nhất. Ngoài việc khẳng định sự tồn tại của gen chuyển trong genome cây nhận thông qua lai DNA tổng số của mẫu phân tích với DNA mẫu dò, lai Southern còn cho biết số lượng bản sao đã được đưa vào cây nhận thông qua số lượng băng vạch dương tính trên phim. Mẫu dò chính là một đoạn của gen chuyển có kích thước từ 100 – 300 bp được đánh dấu phóng xạ hay huỳnh quang. Các bước chính trong kỹ thuật Southern bao gồm: (1) Tách chiết DNA tổng số của mẫu cần phân tích; (2) Xử lý DNA tổng số với 1 – 2 enzyme giới hạn mà điểm cắt không nằm trên gen; (3) Điện di trên gel agarose; (4) Chuyển lên màng nitrosocellulose hay còn gọi là blotting; (5) Tổng hợp sợi DNA mẫu dò có đánh dấu phóng xạ hay huỳnh quang bằng PCR với mồi ngẫu nhiên; (6) Lai mẫu dò với màng DNA và (7) Hiển thị trên phim X quang và phân tích kết quả.
1.5.2.2. Phân tích sự biểu hiện của gen ngoại lai trong cây chuyển gen
Nghiên cứu biểu hiện của gen chuyển là rất cần thiết vì đây chính là mục đích của chuyển gen, nếu gen được đưa vào genome mà không được biểu hiện thì coi như không có giá trị. Biểu hiện gen trong sinh học phân tử là quá trình hoạt động của gen để tạo ra sản phẩm cuối cùng là protein. Quá trình biểu hiện gen được thể hiện qua hai giai đoạn: (1) Phiên mã từ DNA sang mRNA và (2) Dịch mã từ mRNA tổng hợp các phân tử protein thông qua bộ máy ribosome. Để xác định sự có mặt của sản phẩm phiên mã có thể thực hiện phép lai Northern, RT- PCR hoặc lai in situ (lai tại chỗ) còn muốn đánh giá sự có mặt của protein do gen chuyển tạo ra có thể thực hiện một số kỹ thuật khác nhau như kỹ thuật lai
Western, ELISA và các kỹ thuật phát hiện hoạt động của protein (hoặc enzyme). Phương pháp xác định biểu hiện gen qua mRNA Northern blot là một kỹ thuật được sử dụng trong sinh học phân tử để nghiên cứu biểu hiện sự phiên mã của gen bằng cách phát hiện các RNA trong mẫu nghiên cứu (Kevil và cs, 1997). Kỹ thuật lai Northern cho phép tìm hiểu hoạt động điều khiển tế bào qua cấu trúc và chức năng bằng cách xác định mức độ biểu hiện của các gen thành phần trong suốt quá trình biệt hóa, tạo hình cũng như trong các điều kiện bất thường hoặc stress (Schlamp và cs, 2008). Kỹ thuật này được nghiên cứu phát triển từ năm 1977 (Alwine và cs, 1977) và nhanh chóng trở thành công cụ hỗ trợ hữu hiệu trong phân tích cây chuyển gen. Hầu hết các công trình nghiên cứu chuyển gen đều sử dụng kỹ thuật này để phát hiện mRNA của các dòng cây chuyển gen. Về nguyên lý Northern blot cũng dựa trên tính cặp đôi base bổ sung của 2 sợi axit nucleic như Sounthern blot. Trong phương pháp này, RNA tổng số được tách chiết và điện di trên gel agarose, sau đó thấm truyền lên màng lai nitrosocellulose với những mẫu dò đặc biệt được tổng hợp bằng PCR từ gen cần tìm với mồi ngẫu nhiên dài khoảng 6 nucleotide. Các mẫu dò có thể bám lên sợi đơn RNA hoặc sợi đôi DNA. Nếu kết quả dương tính, trên màng lai sẽ xuất hiện những băng sản phẩm lai. Gen được phiên mã càng mạnh thì tín hiệu lai càng rõ. Tác giả Nguyễn Tường Vân (2008) khi lai Northern 2 dòng cao lương SB1 và SB4 chuyển gen ở thế hệ T1 thu được kết quả lai cho thấy vạch lai dòng SB1 đậm hơn dòng SB4 đồng nghĩa với lượng mRNA nhiều hơn điều này rất có thể do hoạt động phiên mã gen của dòng SB1 mạnh hơn.
Kỹ thuật lai Western là một kỹ thuật được sử dụng rộng rãi trong phân tích để phát hiện protein dựa trên nguyên lý của phản ứng miễn dịch giữa kháng nguyên (là sản phẩm protein cần tìm) và kháng thể đặc hiệu đối với kháng nguyên đó. Để tiến hành kỹ thuật này, trước hết protein toàn phần được tách chiết từ mẫu cần phân tích, sau đó điện di trên gel polyacrylamid (PAGE) và thấm truyền protein lên màng lai nitrosocellulose sau đó lai với kháng thể đã được tổng hợp từ trước nhờ kháng nguyên gốc tinh sạch hay kháng nguyên tái tổ hợp thông qua kỹ
thuật sản xuất kháng thể đơn dòng hay đa dòng. Quá trình hiển thị sản phẩm lai có thể thực hiện thông qua phản ứng tạo màu với phosphatase kiềm hay hiện phim thông qua phản ứng dạ quang ECL. Để phát hiện protein trong cây chuyển gen, người ta còn sử dụng kỹ thuật ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay). Đây là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hoặc kháng nguyên trong một mẫu xét nghiệm với độ nhạy cao. ELISA được sử dụng trong nhiều lĩnh vựu nghiên cứu như y học, nông nghiệp và kiểm tra an toàn chất lượng các sản phẩm sinh học. Nguyên lý của ELISA là dựa vào phản ứng kháng nguyên – kháng thể được tiến hành trên pha rắn và gồm các bước chính sau: (1) Kháng nguyên chưa biết được gắn lên một bề mặt; (2) Kháng thể đã biết đã gắn kết với một enzyme được tráng qua bề mặt đó; (3) Thêm vào một cơ chất để enzyme chuyển hóa tạo tín hiệu có thể xác định được bằng máy hoặc có thể nhận biết bằng mắt thường. Trong nghiên cứu có 3 phương pháp chính để tiến hành ELISA bao gồm ELISA gián tiếp, SandwichELISA và ELISA cạnh tranh. Mỗi phương pháp đều có ưu điểm riêng của nó và tùy từng điều kiện có thể sử dụng bất kỳ phương pháp nào. Trong nghiên cứu chuyển gen thực vật ELISA thường dùng để nhận biết sự có mặt của protein được mã hóa bởi gen chuyển để đánh giá sơ bộ mức độ biểu hiện gen đó. Ngoài ra đối với thực vật chuyển gen kháng virus, kỹ thuật này được sử dụng để kiểm tra mức độ kháng của các dòng cây chuyển gen thông qua lượng virus suy giảm sau một thời gian lấy nhiễm trên các dòng cây chuyển gen và đối chứng (Phạm Thị Vân, 2009).