Trong vùng T-DNA của vector chuyển gen có thiết kế gen GS1 và gen
nptII kháng kanamycin, do đó, một cây chuyển gen hoàn chỉnh phải tồn tại song song cả hai cấu trúc gen này. Hoạt động của gen nptII trong cây là một yếu tố giúp đánh giá và sàng lọc sơ bộ cây chuyển gen ở giai đoạn nhà lưới (in vivo). Trong tế bào cây không chuyển gen, hoạt động của kanamycin dựa trên ảnh hưởng của nó lên ty thể và lục lạp, trong đó kanamycin gây cản trở quá trình tổng hợp protein ở lạp thể làm lục lạp không được tổng hợp mới, đồng thời phá hủy diệp lục và các sắc tố làm lá cây bị bạc màu (cháy lá) (Nap, 1992). Ngược lại, ở những tế bào hay những cây chuyển gen chứa cấu trúc gen nptII mã hóa tổng hợp enzyme neomycin phosphotranferase có khả năng phân giải kháng sinh kanamycin giúp bảo vệ sắc tố diệp lục và giữ lại được màu xanh trên lá.
Kanamycin có khả năng thấm qua màng sinh chất của tế bào, cũng như các bào quan bên trong tế bào. Tuy nhiên, do tính thấm kanamycin ở màng tế bào nhân chuẩn thấp, do đó, khi nghiên cứu hoạt động của kanamycin trong tế bào nhân chuẩn cần nồng độ cao (Nap, 1992). Trong thí nghiệm này, kháng sinh kanamycin được pha ở các nồng độ 0, 500, 1000, 1500 và 2000 mg/lít (gấp 5 - 10 lần nồng độ sử dụng trong điều kiện in vitro), sau đó sử dụng các dung dịch này để đánh giá tính kháng kháng sinh trên lá bằng cách như sau: Giấy thấm được cắt thành các mảnh nhỏ có kích thước 1,0 x 1,0 cm rồi ngâm trong dung dịch kanamycin (30 - 60 phút), dùng phanh đặt giấy thấm kháng sinh lên bề mặt lá bánh tẻ. Để xác định được nồng độ kháng sinh kanamycin phù hợp để sàng lọc cây chuyển gen, chúng tôi tiến hành đánh giá mức độ thiệt hại do kanamycin gây ra trên cây đối chứng không chuyển gen (ký hiệu: wt).
Kết quả thí nghiệm trên cây wt thu được như bảng 3.2 cho thấy: nồng độ kháng sinh kanamycin 2000 mg/l 100% số mẫu thí nghiệm bị cháy lá sau 5 ngày theo dõi. Qua đó thấy rằng nồng độ 2000 mg/l kanamycin là ngưỡng gây chết, làm tổn thương rất lớn đến tế bào thực vật. Ở nồng độ kanamycin 500 mg/l số
mẫu thí nghiệm bị cháy lá theo dõi sau 15 ngày là 38,1%, có thể thấy nồng độ thấp kanamycin không đủ để gây tổn thương lớn đến tế bào, nên các cây không chuyển gen vẫn có khả năng kháng và sinh trưởng được. Khi tăng nồng độ kanamycin lên 1000 mg/l, mặc dù tỉ lệ cháy lá tăng lên 70,4-74,3% sau 10-15 ngày, nhưng các vị trí đánh giá tính kháng kháng sinh lá chưa bạc trắng hoàn toàn. Khi thí nghiệm trên nồng độ 1500 mg/l sau 5 ngày thí nghiệm ghi nhận được 73,9% mẫu bị cháy lá, sau 10 ngày 100% số mẫu bị cháy lá hoàn toàn. Bên cạnh đó, kết quả cũng ghi nhận tỉ lệ cháy lá sau 10 ngày và 15 ngày không có sự chênh lệch nhiều (ở nồng độ 500 mg/l tăng từ 31,7% sau 10 ngày lên 38,1% sau 15 ngày; ở nồng độ 1000 mg/l tỉ lệ cháy lá là 70,4% sau 10 ngày và 74,3% sau 15 ngày), điều này có thể là do sau 15 ngày kanamycin bị phân hủy và mất hoạt tính dần trong điều kiện ánh sáng và nhiệt độ cao. Do đó, chúng tôi lựa chọn nồng độ 1500 mg/l kanamycin là phù hợp để sàng lọc các cây chuyển gen trong điều kiện nhà lưới sau 10 ngày.
Bảng 3.2: Ảnh hưởng của kanamycin đến tỉ lệ cháy lá ở bạch đàn Urô không chuyển gen Nồng độ kanamycin (mg/l) Tỉ lệ cháy lá sau 5 ngày (%) Tỉ lệ cháy lá sau 10 ngày (%) Tỉ lệ cháy lá sau 15 ngày (%) 0 0 0 0 500 22,3 ± 4,5 d 31,7 ± 3,7 c 38,1 ± 4,1 b 1000 51,2 ± 4,2 c 70,4 ± 2,8 b 74,3 ± 2,9 c 1500 73,9 ± 6,5 b 100 a 100 a 2000 100 a 100 a 100 a
Ghi chú: Trong phạm vi cùng một cột, các giá trị mang các chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức α = 0,05.
dòng cây chuyển gen trong 10 ngày bằng phương pháp điểm trên lá. Kết quả thu được 15/41 dòng chuyển gen GS1 và nptII kháng kháng sinh 1.500 mg/l kanamycin đây là các dòng có mức độ biểu hiện gen nptII mạnh. Các dòng còn lại và cây không chuyển gen lá bị chuyển màu vàng và thủng lỗ sau 10 ngày đánh giá tính kháng kháng sinh (bảng 3.3 và hình 3.2). Kết quả thu được có thể coi là bước khảo sát ban đầu và có tác dụng định hướng các nghiên cứu tiếp theo đối với các dòng cây giả định chuyển gen GS1.
Bảng 3.3: Kết quả đánh giá tính kháng kháng sinh kanamycin của các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 ở nhà lưới
Ký hiệu dòng nghiên cứu Kháng Kan Ký hiệu dòng nghiên cứu Kháng Kan Ký hiệu dòng nghiên cứu Kháng Kan WT - E-X14 - E-X28 -
E-X1 + E-X15 - E-X29 +
E-X2 - E-X16 + E-X30 -
E-X3 - E-X17 + E-X31 -
E-X4 + E-X18 - E-X32 +
E-X5 - E-X19 - E-X33 -
E-X6 - E-X20 + E-X34 -
E-X7 + E-X21 - E-X35 +
E-X8 - E-X22 - E-X36 +
E-X9 - E-X23 - E-X37 +
E-X10 - E-X24 - E-X38 -
E-X11 - E-X25 + E-X39 -
E-X12 + E-X26 - E-X40 -
E-X13 + E-X27 - E-X41 +
Ghi chú: (+): Chỉ các dòng dương tính, kháng sinh kanaycin; (-): Chỉ các dòng âm tính, lá bị cháy và thủng lỗ sau 10 ngày. Kan: kanamycin.
Hình 3.2.Các dòng Bạch đàn urô chuyển gen GS1 trồng ở nhà lưới và đánh giá tính kháng kháng sinh.
A - cây 3 tháng tuổi đánh giá tính kháng kanamycin bằng phương pháp đặt giấy thấm kanamycin trên lá bénh tẻ; B - dòng không kháng kanamycin
1.500 mg/l; C- dòng kháng sinh kanamycin 1.500 mg/l.