thuật RT-PCR
RT-PCR (Reverse transcription PCR) là phương pháp PCR mà axit nucleic đích cần phát hiện là RNA. Do vậy, kỹ thuật này giúp xác định mức độ biểu hiện phiên mã của gen GS1 trong cây chuyển gen. Để có thể thực hiện được phản ứng PCR này thì trước hết RNA đích phải được phiên mã ngược thành cDNA, rồi sau đó sẽ dùng PCR để khuếch đại trình tự đích trong cDNA bằng cặp mồi đặc hiệu cho trình tự này. Vì phải thực hiện hai giai đoạn RT rồi mới đến PCR nên kỹ thuật này được gọi là kỹ thuật RT – PCR. Đồng thời, kĩ thuật
M P wt 1 2 3 4 5 6 7 8 20 10 7 5 4 3 2 1.5
này cũng giúp so sánh, đánh giá sơ bộ mức độ phiên mã của từng dòng cây chuyển gen dựa vào độ sáng của các băng DNA sau phản ứng PCR.
Để có thể so sánh được mức độ biểu hiện phiên mã của từng dòng cây chuyển gen, trước khi sử dụng cho phân tích RT-PCR, mẫu RNA tổng số của các dòng được định lượng bằng Nanodrop và pha loãng về cùng nồng độ (200 ng/µl) trước khi đưa vào phản ứng tổng hợp cDNA. Vì vậy, kết quả điện di sản phẩm PCR bằng mồi actin cho thấy các băng có độ sáng tương tự nhau (Hình 3.8B).
Đối với mồi GS1-tF/GS1-tR, do kích thước của đoạn GS1 lớn hơn actin nên chúng tôi sử dụng một lượng cDNA nhỏ hơn (1µl so với 2µl trong phản ứng của mồi Actin). Kết quả cho thấy, mẫu 5 và 7 hoàn toàn âm tính với phản ứng RT-PCR, trước đó, mẫu này cũng được xác định âm tính với Southern blot mặc dù hai mẫu này dương tính với phản ứng PCR trước đó. Điều này có thể do hiện tượng dương tính giả. Các mẫu còn lại dương tính với RT-PCR, tuy nhiên khi so sánh độ sáng cho thấy sự khác nhau của các băng (Hình 3.8A). Điều này liên quan đến hàm lượng mRNA GS1 trong tế bào, hay nói cách khác là khả năng phiên mã của gen GS1 ở mỗi dòng bạch đàn Urô chuyển gen là khác nhau. Biểu hiện gen GS1 ở dòng số 3 (E-X17) là mạnh nhất.
Hình 3.8. Ảnh điện di sản phẩm RT-PCR các dòng cây bạch đàn Urô chuyển gen GS1 bằng mồi GS1-F/R và Act-F/R.
Ghi chú: 1 - 7: các dòng cây chuyển gen GS1 (tương ứng E-X7, E-X16, E-X17, E-X20, E-X25, E-X29, E-X32); P - đối chứng dương (pBI121-GS1); wt: cây không chuyển gen; M: Marker 1 Kb. (-): H2O; Hình A - nhân gen GS1; Hình B
- gen Actin. P 7 6 5 4 3 2 1 wt M 7 6 5 4 3 2 1 wt (-) A B 1.0 kb 157bp