thuật PCR
PCR là kỹ thuật phổ biến và đơn giản nhất để bước đầu sàng lọc các dòng cây chuyển gen. Kết quả của phản ứng cho phép khẳng định sự tồn tại hay không tồn tại của gen chuyển trong genome của cây chuyển gen . Khi các dòng bạch đàn Urô giả định chuyển gen xuất hiện 4-5 cặp lá mới, tiến hành thu mẫu lá tách chiết DNA tổng số để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển (GS1 và nptII) và các trình tự promoter 35S-P, trình tự kết thúc NOS-T bằng kĩ thuật PCR. Các DNA tổng số tách chiết từ các dòng bạch đàn Urô giả định chuyển gen (E-X1 - E- X41) và cây không chuyển gen (Ký hiệu: wt) được sử dụng làm khuôn trong phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu GS1-tF (5’-GAT GAA GAG ACA TGG TAC GGG-3’) và GS1-tR (5’-GGA CTT GGT GCT GTA ATT TGT G-3’) nhân gen
GS1 có kích thước 408 bp. Kết quả thu được cho thấy, trong 41 dòng bạch đàn Urô giả định chuyển gen phân tích có 7 dòng (E-X7, E-X16, E-X17, E-X20, E- X25, E-X29, E-X32) xuất hiện một băng duy nhất, sắc nét có kích thước 408 bp so với thang chuẩn DNA 100 bp và bằng với đối chứng dương (khuôn vector pBI121-GS1), các dòng này cũng nằm trong nhóm 15 dòng dương tính với thí nghiệm đánh giá tính kháng kanamycin ở nhà lưới được thực hiện trước đó, các
dòng còn lại và dòng đối chứng âm (wt) không xuất hiện băng DNA này (hình 4.4). Qua đây cũng thấy rằng, sàng lọc cây chuyển gen bằng các hóa chất chọn lọc là một bước giúp định hướng, khoanh vùng được các dòng có khả năng cao là cây chuyển gen. Tuy nhiên, muốn khẳng định chắc chắn các dòng chuyển gen cần thực hiện các kĩ thuật sinh học phân tử.
Hình 3.3. DNA tổng số tách chiết từ các dòng bạch đàn Urô giả định chuyển gen GS1
Hình 3.4. Sản phẩm PCR nhân đoạn gen GS1 từ các dòng bạch đàn Urô chuyểngen.
Ghi chú: M - thang DNA chuẩn 100 bp; (+) đối chứng dương (pBI121-GS1); wt - cây không chuyển gen; đường chạy từ 1-36 tương ứng với mẫu E-X1 đến E-
X36.
Bên cạnh việc kiểm tra sự có mặt của gen GS1, DNA tổng số của 41 dòng bạch đàn Urô giả định chuyển gen GS1 và dòng wt được sử dụng làm khuôn để phân tích sự có mặt của gen chọn lọc (gen nptII) bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân gen nptII có kích thước 700 bp (NPTII-F: 5’-GAG GCT ATT CGG CTA TGA CTG-3’; NPTII-R: 5’-ATC GGG AGC GGC GAT ACC GTA-3’) tham khảo Tadeusz Wroblewski và cộng sự (2007). Kết quả cho thấy 7 dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 (E-X7, E-X16, E-X17, E-
w t
M + wt 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 M 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36
X20, E-X25, E-X29, E-X32) trước đó dương tính với phản ứng PCR gen GS1
với mồi đặc hiệu, xuất hiện một băng DNA có kích thước khoảng 700 bp so với thang DNA chuẩn 1 kb, rõ nét, bằng với mẫu đối chứng dương; ngược lại, mẫu wt đối chứng âm (cây không chuyển gen) không có xuất hiện băng DNA này (Hình 3.5). Kết quả này khẳng định 7/41 dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1
phân tích mang cả gen chọn lọc nptII và gen mục tiêu GS1.
Hình 3.5. Sản phẩm PCR nhân đoạn gen nptII từ các dòng bạch đàn Urô chuyển gen.
Ghi chú: M - thang DNA chuẩn 1 kb; P- đối chứng dương (pBI121-GS1); wt - cây không chuyển gen; đường chạy từ 1 - 41 tương ứng với mẫu E-X1 EX41. Ngoài việc kiểm tra gen mục tiêu (gen GS1), gen chọn lọc (gen nptII), để khẳng định 7 dòng bạch đàn Urô (E-X7, E-X16, E-X17, E-X20, E-X25, E-X29, E-X32) chuyển gen trước đó đã dương tính với phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu gen GS1 và gen nptII, trong nghiên cứu này để chắc chắn cấu trúc T- DNA trong vector chuyển gen đã được chuyển đầy đủ vào cây nhận gen, chúng tôi đã sử dụng cặp mồi đặc hiệu p35S-cf3: 5’- CCA CGT CTT CAA AGC AAG TGG-3’/p35S-cr4: 5’- TCC TCT CCA AAT GAA ATG AAC TTC C -3’ để nhân một đoạn khởi động 35S-Promoter có kích thước khoảng 123 bp và cặp mồi HA-nos-f: 5’-GCA TGA CGT TAT TTA TGA GAT GGG-3’/HA-nos-r: 5’- GAC ACC GCG CGC GAT AAT TTA TCC-3’ để nhân một đoạn trình tự kết thúc NOS-T có kích thước khoảng 118 bp. Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 2%, kết quả thu được như hình 3.6. Kết quả cũng cho thấy 7 dòng bạch đàn Urô chuyển gen xuất hiện một băng DNA có kích thước khoảng 123
700bp
700bp
M P wt 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
M P wt 18 19 202122 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34
bp và 118 bp so với thang DNA chuẩn 100 bp, đậm, rõ nét và bằng với mẫu đối chứng dương. Trong khi đó, mẫu wt (cây không chuyển gen) không có xuất hiện băng DNA này. Kết quả này khẳng định 7 dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 phân tích mang đầy đủ cassette gen chuyển (LB-NOS-P-nptII- NOS-T/35S-P-GS1-NOS-T- RB). Tuy nhiên, để khẳng định chắc chắn các dòng này là dòng chuyển gen cũng như xác định số bản copy của gen chuyển trong