GS1
3.7.1. Sinh trưởng về chiều cao của các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 trồng trong nhà lưới
Các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 (E-X7, E-X16, E-X17, E-X20, E-X29) và dòng đối chứng âm không chuyển gen được nhân giống vô tính và trồng trong chậu đất ở điều kiện nhà lưới có cùng điều kiện về nhiệt độ, độ ẩm, ánh sáng và dinh dưỡng. Mỗi lô thí nghiệm được bố trí số lượng cây con tối thiểu là 30 cây với 3 lần lặp lại. Chiều cao của các dòng bạch đàn Urô chuyển gen và cây đối chứng không chuyển gen được xác định ở các thời điểm 1 tháng tuổi, 2 tháng tuổi và 3 tháng tuổi sau khi đưa từ phòng thí nghiệm ra trồng ngoài nhà lưới. M P wt 1 2 3 4 5 100 bp M P wt 1 2 3 4 5 100 bp A B
Bảng 3.4. Sinh trưởng về chiều cao của các dòng Bạch đàn Urô chuyển gen GS1 và đối chứng
Dòng nghiên cứu
Chiều cao trung bình (cm) Tỷ lệ vượt của dòng chuyển gen GS1/wt
ở cây 3 tháng tuổi 1 tháng tuổi 2 tháng tuổi 3 tháng tuổi
Đối chứng (wt) 13,73 ± 1,84f 24,95 ± 1,29e 36,46 ± 1,24d
Dòng E-X7 16,87 ± 0,87c 30,64 ± 0,91d 46,49 ± 0,83b 27,5%
Dòng E-X16 17,52 ± 0,52e 31,45 ± 0,65f 46,79 ± 0,80c 28,3%
Dòng E-X17 15,79 ± 0,81b 28,93 ± 1,24c 44,71 ± 0,90f 22,6%
Dòng E-X20 15,32 ± 0,71d 28,67 ± 0,83a 42,65 ± 0,72e 17,0%
Dòng E-X29 15,56 ± 0,65a 29,08 ± 1,20b 44,57 ± 0,74a 22,2%
Ghi chú: Trong phạm vi cùng một cột, các giá trị mang các chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức α = 0,05.
Kết quả thu được như bảng 3.4 cho thấy, các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 đều sinh trưởng chiều cao nhanh hơn hẳn so với cây đối chứng không chuyển gen ở giai đoạn 3 tháng tuổi từ 17-28,3%. Kết quả cũng cho thấy ở giai đoạn 1 tháng tuổi, chiều cao của cây chuyển gen và đối chứng hầu như không có sự khác biệt rõ ràng, chiều cao trung bình của dòng không chuyển gen 13,73 cm, còn chiều cao của các dòng chuyển gen giao động từ 15,32 – 17,52 cm. Điều đó là do, ở giai đoạn đầu mới trồng (1 tháng tuổi) các cây chủ yếu tập trung thích nghi với điều kiện tự nhiên, do vậy sự chênh lệch về chiều cao cây và số lá mới tăng thêm giữa các dòng chuyển gen và đối chứng là chưa nhiều. Sau 2 - 3 tháng tuổi trồng cây trong chậu đất ở điều kiện nhà lưới, sự chênh lệch về chiều cao cây và số lá mới tăng thêm giữa các dòng chuyển gen và đối chứng khá đáng kể. Sau thời gian đó, bước sang giai đoạn cây 2 tháng tuổi, sinh trưởng về chiều cao của các dòng cây chuyển gen bắt đầu có sự khác biệt rõ hơn với dòng đối chứng
không chuyển gen, chiều cao trung bình của dòng đối chứng không chuyển gen là 24,95 cm, ngược lại chiều cao trung bình của các dòng chuyển gen dao động từ 28,67 – 31,45 cm. Giai đoạn 3 tháng tuổi chiều cao của dòng cây chuyển gen vượt rõ rệt so với dòng đối chứng không chuyển gen, độ vượt giữa các dòng chuyển gen so với đối chứng dao động từ 17 – 28,3%. Dòng chuyển gen E-X7 và E-X16 có độ vượt về chiều cao so với dòng đối chứng lớn nhất là 27,5% và 28,3%. Dòng E-X17 và E-X29 sinh trưởng về chiều cao gần tương đương nhau, độ vượt so với đối chứng là 22,2% và 22,6%. Dòng E-X20 sinh trưởng về chiều cao có độ vượt so với dòng đối chứng là thấp nhất 17% ở giai đoạn cây 3 tháng tuổi trồng trong chậu đất ở nhà lưới. Có sự khác biệt này có thể do mức độ biểu hiện của gen chuyển trong các dòng cây chuyển gen là khác nhau. Về kiểu hình thân, lá không có sự khác biệt giữa các dòng chuyển gen so với cây không chuyển gen.
Hình 3.14. Tăng trưởng về chiều cao cây của các dòng bạch đàn chuyển gen GS1 và đối chứng (wt) ở giai đoạn 3 tháng tuổi ở nhà lưới.
Ta thấy, độ vượt sinh trưởng về chiều cao của cây chuyển gen so với cây đối chứng không chuyển gen tăng lên khi thời gian trồng ở nhà lưới tăng lên. Bên cạnh đó, có sự khác biệt trong tăng trưởng chiều cao giữa các dòng chuyển gen với nhau, dòng E-X7 và E-X16 có sinh trưởng tương đương nhau và nhanh hơn so với các dòng còn lại (Hình 3.14). Tuy nhiên, đây mới chỉ là đánh giá
bước đầu cây chuyển gen ở giai đoạn vườn ươm/nhà lưới, để có thể đưa ra những kết luận chính xác hơn cần tiếp tục đưa cây ra trồng trong điều kiện tự nhiên và đánh giá ở các giai đoạn cây 12, 24 và 36 tháng tuổi. Bên cạnh đó, những kết quả đánh giá sinh trưởng chiều cao giữa cây bạch đàn Urô chuyển gen
GS1 so với cây đối chứng không chuyển gen cũng gần tương đương với một số công trình đã công bố khi chuyển gen GS1 trên đối tượng cây Dương lai của một số tác giả trên thế giới (Gallardo và cs, 1999; Fu và cs, 2003; Man và cs, 2011).
Hình 3.15. Kiểu hình của dòng cây chuyển gen GS1 và đối chứng không chuyển gen giai đoạn 3 tháng tuổi.
3.7.2. Đánh giá sinh khối tươi của các dòng Bạch đàn urô chuyển gen GS1 và đối chứng giai đoạn vườn ươm
Bên cạnh việc đánh giá sinh trưởng về chiều cao của các cây chuyển gen và cây đối chứng, sinh khối tươi cũng là chỉ tiêu được chúng tôi sử dụng để so sánh. Tổng sinh khối tươi của các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 và dòng đối chứng không chuyển gen (wt) trồng trong chậu đất ở nhà lưới 3 tháng tuổi. Các cây sau khi đo xác định chiều cao, được rửa sạch đất và cân tổng sinh khối tươi toàn cây. Kết quả thu được như trình bày ở bảng 3.5:
Bảng 3.5. Sinh khối tươi của các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 và đối chứng (wt)
Mẫu nghiên cứu Tổng sinh khối tươi (g) Tỷ lệ sinh khối tăng (%) Đối chứng (wt) 4,50 ± 0,18f Dòng E-X7 5,56 ± 0,27e 23,56 Dòng E-X16 5,63 ± 0,10b 25,11 Dòng E-X17 5,25 ± 0,13d 16,67 Dòng E-X20 5,09 ± 0,11c 13,11 Dòng E-X29 5,28 ± 0,12a 17,33 Trung bình 5,36 ± 0,15 19,16
Ghi chú: Trong phạm vi cùng một cột, các giá trị mang các chữ cái khác nhau chỉ sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức α = 0,05.
Kết quả thu được cho thấy, tổng sinh khối tươi toàn cây của các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 tăng cao hơn so với dòng đối chứng khá rõ rệt. Dòng E-X7 và E-X16 tổng sinh khối tươi toàn cây là 5,56 g và 5,63 g vượt hơn so với đối chứng là 23,56% và 25,11%. 3 dòng chuyển gen GS1 còn lại là E- X17, E-X20 và E-X29 tổng sinh khối tăng vượt so với dòng đối chứng (wt) lần lượt là 16,67%, 13,11%, 17,33%. Giá trị tăng trung bình về tổng sinh khối giữa các dòng chuyển gen và đối chứng không chuyển gen là 19,16%. Tuy nhiên, các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 mới được đưa ra trồng giai đoạn vườn ươm 3 tháng tuổi nên chưa đánh giá được sinh trưởng, phát triển ở giai đoạn rừng trồng. Cần tiếp tục có các nghiên cứu đánh giá sinh trưởng về sinh khối của cây chuyển gen so với cây đối chứng ở giai đoạn rừng trồng để có cơ sở lựa chọn được cây đủ tiêu chuẩn làm giống.
Hình 3.16. Sinh khối của các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 và đối chứng không chuyển gen (wt).
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
1) Đã sàng lọc được 41 chồi bạch đàn Urô chuyển gen GS1 ra rễ trên môi trường ra rễ chọn lọc chứa kháng sinh kanamycin 75 mg/l. Phân tích bằng các kĩ thuật sinh học phân tử xác định được 5 dòng cây chuyển gen (E-X7, E-X16, E- X17, E-X20 và E-X29) cho thấy mức độ ổn định của gen chuyển sau 5 chu kì nhân giống vô tính.
2) Đánh giá sinh trưởng của 5 dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 (ký hiệu: E-X7, E-X16, E-X17, E-X20, E-X29) cho thấy các dòng có độ vượt chiều cao từ 17 – 28,3% và độ vượt sinh khối tươi từ 13,11% - 25,11% so với dòng đối chứng không chuyển gen.
Kiến nghị
1) Tiếp tục xác định mức độ biểu hiện protein của gen GS1 trong các dòng bạch đàn Urô chuyển gen thông qua các kĩ thuật như Western blot, ELISA…
2) Tiếp tục theo dõi và đánh giá sinh trưởng của các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 so với cây đối chứng không chuyển gen ở giai đoạn nhà lưới qua các chỉ tiêu sinh trưởng đường kính thân, sinh khối khô toàn cây, diện tích lá, điều kiện nghèo nitơ…
3) Đánh giá sinh trưởng của các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 so với cây đối chứng không chuyển gen ở điều kiện đồng ruộng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt:
1. Nguyễn Thị Hồng Gấm, Trần Thị Hương Giang, Bùi Phương Thảo, Nguyễn Văn Đoài, Nguyễn Thị Thơm, Bùi Văn Thắng, Phạm Bích Ngọc, Chu Hoàng Hà (2016), Tạo cây thuốc lá chuyển gen GS1 tăng cường hiệu quả sử dụng nitrogen, Tạp chí Công nghệ sinh học, Số 3/2016.
2. Lê Đình Khả (2006), Lai giống cây rừng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
3. Nguyễn Hoàng Nghĩa (2000), Chọn giống bạch đàn Eucalyptus theo sinh trưởng và kháng bệnh ở Việt Nam, Nhà xuất bản Nông nghiệp.
4. Quyết định 4861/QĐ-BNN-TCLN của Bộ NN và PTNT ngày 17/11/2014. 5. Thông tư số 44/2015/TT-BNNPTNT ngày 23/11/2015 của Bộ trưởng Bộ
NN&PTNT.
6. Phạm Thị Vân (2009), Nghiên cứu tạo cây thuốc lá kháng bệnh khảm bằng kỹ thuật RNAi. Luận văn Thạc sỹ sinh học.
Tài liệu tiếng Anh:
1. Alwine J. C., D. J Kemp and G. R. Stark (1977), Method for detection of specific RNAs in agarose gels by transfer to diazobenyloxymethyl-paper and hybridization with DNA probes, PNAS 74(12), pp. 5350-5354.
2. Anuário Estatístico Da Abraf (2013). Ano base 2011. Brasília, DF: ABRAF, 2012. 136 p. Disponível em: 227 | Rev. Geama, Recife – 3 (4): 216-228.
Out-Dez 2017. | Online version ISSN: 2447-0740 |
http://www.geama.ufrpe.br .
3. Becker T. W., Caboche M., Carrayol E. and Hirel B. (1992), Nucleotide sequence of a tobacco cDNA encoding plastidic glutamine synthetase and light-inducibility, organ specificity and diurnalrhythmicity in the expression of the corresponding genes of tobacco and tomato, Plant Molecular Biology 19, pp. 367-379.
4. Boland DJ, Brooker MIH, Chippendale GM, Hall, NH, BP M, Johnson RD. (2006), Forest trees of Australia, Melbourne, CSIRO, Australia.
5. Cantón F. R., Suarez M. F., Jose-Estanyol M. and Cánovas F. (1999), Expression analysis of a cytosolic glutamine synthetase genein cotyledons of scots pine seedlings: Developmental regulationand spatial distribution of specific transcripts, Plant Molecular Biology 40, pp. 623-634.
6. Clarke B, McLeod I, Vercoe T. (2009), Trees for Farm Forestry: 22 promising species, The Rural Industries Research and Development Corporation, Barton, Kingston.
7. Clemente M. T. and Marquez A. J. (1999), Site-directed mutagenesis of Glu-297 from the [alpha] – polypeptide of Phaseolus vulgaris glutamine synthetase alters kinetic and structural propertiesand confers risistance to L-methionine sulfoximine, Plant Molecular Biology 40, pp. 835-845. 8. Cren M. and Hirel B. (1999), Glutamine synthetase in higher phants:
Regulation of gene and protein expression from theorgan to the cell, Plant Cell Physiology 40, pp. 1187-1193.
9. Dubois F., Brugière N., Sangwan R. S. and Hirel B. (1996), Localisation of tobacco cytosolic glutamine synthetase enzymes and the corresponding transcripts show organ-and cell-specific patterns of protein synthesis and gene expression, Plant Molecular Biology 31, pp. 803-817
10. Eldridge K, Davidson J, HarwoodC and Van Wyk G (1993), Eucalyptus Domestication and Breeding. Oxford University Press, Oxford.
11. Elsbeth L. Walker, N. F. Weeden, Crispin B. Taylor, Pamela Green, Gloria M. Coruzzi, (1995), Molecular evolution of duplicate copies of genes encoding cytosolic glutamine synthetase in Pisum sativum, Plant Molecular Biology 29, pp. 1111-1125.
12. FAO (2004), Priliminary review of biotechnology in forestry including genetic modification.
13. Fu J., R. Sampalo, F. Gallardo, F. M. Cánovas and E. G. Kirby (2003), Assembly of a cytosolic pine glutamine synthetase holoenzyme in leaves of transgenic poplar leads to enhanced vegetative growth in young plants,
Plant, Cell and Environment 26, pp. 411–418.
14. Fuentes S. I., Allen D. J., Ortiz-Lopez A. and Hernández G. (2001), Over expression of cytosolic glutamine synthetase increases photosynthesis and grow at low nitrogen concentrations, Joural Experimental Botany 52, pp. 1071-1081.
15. Gallardo F., J. Fu, F. R. Canton, A. Garcia-Gutierrez, F. M. Cánovas and E. G. Kirby (1999), Expression of a conifer glutamine synthetase gene in transgenic poplar, Planta 210, pp. 19–26.
16. GIT Forestry (2008), Cultivated eucalyptus global map 2008, http:// www.git-forestry.com.
17. GLOBAL Eucalyptus map: a cartography information resource depicting Eucalyptus cultivated forests worldwide, (2009).
18. Grupo Sustainable Forest Management and Eucalyptus. Grupo Empresarial ENCE, S.A. 2009, 76.
19. Hung TD, Brawner JT, Mede R, Lee DJ, Southerton S, Thinh HH, Dieters MJ. (2015), Estimates of genetic parameters for growth and wood properties in Eucalyptus pellita F. Muell. to support tree breeding in Vietnam, Annals of Forest Science 72, pp. 205‒217.
20. Iglesias TG, Wilstermann D. Eucalyptus universalis. Global Cultivated Eucalyptus Forests Map 2008 version 1.0.1.In: GIT Forestry Consulting’s Eucalyptoligics: Information resources on Eucalyptus cultivation worldwide, (2008).
21. Ishiguri F, Diloksumpun S, Tanabe J, Iizuka K, Yokota S. (2013), Stress- wave velocity of tree and dynamic Youngʼs modulus of logs of 4-year-old
Eucalyptus camaldulensis trees selected for pulpwood production in Thailand, Journal of Wood Science 59, pp. 506‒511.
22. Ireland, R. J. and Lea, Peter John (1999), The enzymes of glutamine, glutamate, asparagine and aspartate metabolism, Plant Amino Acids : biochemistry and biotechnology: Marcel Dekker Inc, New York, pp. 49- 109.
23. Jacek Biesiadka , Andrzej B. Legocki (1997), Evolution of the glutamine synthetase gene in plants, Plant Science 128, pp. 51–58.
24. Jing Z. P., F. Gallardo, M. B. Pascual, R. Sampalo, J. Romero, A. Torres, D. E. Navarra and F. M. Cánovas (2004), Improved growth in a field trial of transgenic hybrid poplar overexpressing glutamine synthetase, New Phytologiist 164, pp. 137–145.
25. Keadtidumrongkul Pornthep, Anongpat Suttangkakul, Phitsanu Pinmanee, Kanokwan Pattana, Chokchai Kittiwongwattana, Somsak Apisitwanich, Supachai Vuttipongchaikij (2017), Growth modulation effects of CBM2a under the control of AtEXP4 and CaMV35S promoters in Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum and Eucalyptus camaldulensis, Transgenic Res, DOI 10.1007/s11248-017-0015-4.
26. Kevil Christopher G., Loren Walsh, F. Stephen Laroux, Theodore Kalogeris, Mathew B. Grisham, J.S. Alexander (1997), An improved, rapid Northern protocol, Biochemical and Biophysical Research Communications 238(2), pp. 277-279.
27. Min-gang Li, Richard Villemur, Patrick J. Hussey, Carolyn D. Silflow, J Stephen Gantt, D. Peter Snustad (1993), Differential expression of six glutamine synthetase genes in Zea mays, Plant Molecular Biology 23(2),
pp. 401-407.
28. Man Huimin, Stephan Pollmann, Elmar W. Weiler, Edward G. Kirby (2011), Increased glutamine in leaves of poplar transgenic with pine GS1a caused greater anthranilate synthetase α-subunit (ASA1) transcript and
protein abundances: an auxin-related mechanism for enhanced growth in GS transgenics?, Journal of Experimental Botany 62(13), pp. 4423–4431. 29. Matsuoka, T., et al. (2001), A multiplex PCR method of detecting
recombinant DNAs from five lines of genetically modified maize,
Shokuhin Eiseigaku Zasshi 42 (1), pp. 24–32.
30. Miflin B. J. and Lea P. J. (1980), Ammonia assimilation. In: Miflin BJ, ed.
The biochemistry of plants, vol 5. San Diego, CA, USA: Academic Press, pp. 169–202.
31. Miflin B. J. and Habasd Dimah Z. (2002), The role of glutamine synthetase and glutamate dehydrogenase in nitrogen assimilation and posibilities for improvement in the nitrogen utilization of crops, Journal of Experimental
Botany 53(370), pp. 979-987.
32. Nap Jan-Peter, Jacques Bijvoet and Willem J. (1992), Biosafety of
kanamycin-resistant transgenic plants, Transgenic Research 1, pp. 239- 249.
33. Norbert Brugière, Frédéric Dubois, Céline Masclaux, Rajbir S. Sangwan, Bertrand Hirel (2000), Immunolocalization of glutamine synthetase in senescing tobacco (Nicotiana tabacum L.) leaves suggests that ammonia assimilation is progressively shifted to the mesophyll cytosol, Planta 211, pp. 519-527.
34. Nozomu Sakurai, Toshihiko Hayakawa, Teiji Nakamura,
Tomoyuki Yamaya (1996), Changes in the cellular localization of cytosolic glutamine synthetase protein in vascular bundles of rice leaves at various stages of development, Planta 200, pp. 306-311.
35. Oguchi Taichi, Yuko Kashimura, Makiko Mimura, Xiang Yu, Etsuko Matsunaga, Kazuya Nanto, Teruhisa Shimada, Akira Kikuchi, Kazuo N. Watanabe (2014), A multi-year assessment of the environmental impact of transgenic Eucalyptus trees harboring a bacterial choline oxidase gene
on biomass, precinct vegetation and the microbial community, Transgenic Res, DOI 10.1007/s11248-014-9809-9.
36. Oliveira Igor C., Timothy Brears, Thomas J. Knight, Alexandra Clark, and