đàn Urô chuyển gen GS1
Sau khi đã xác định được chắc chắn 5 dòng bạch đàn Urô, mức độ ổn định của gen chuyển trong cây cần được xác định thông qua quá trình nhân giống vô tính. Từ 5 dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1, mỗi dòng 1 chồi, tiến hành nhân giống vô tính qua 5 chu kỳ. Từ một chồi/dòng chuyển gen ở thế hệ T0, cắt thành các đoạn nhỏ và nhân giống chu kỳ 1 (CK1) thu được mỗi dòng 1 bình chồi với số lượng 3 – 5 cụm chồi, mỗi cụm 10 - 15 chồi, sau 3 tuần nuôi cấy. Tiếp tục nhân các chồi qua các chu kỳ (CK2, CK3, CK4) với hệ số nhân gấp khoảng 5 lần sau 3 tuần nuôi cấy (1 bình chồi nhân thành 5 bình chồi). Trong quá trình nuôi cấy loại bỏ các bình bị nhiễm khuẩn và nấm. Ở chu kỳ 5 (CK5), chọn 10 bình chồi tốt nhất ở CK4 để nhân giống, kết quả thu được 50 bình chồi/dòng chuyển gen ở CK5 phát triển tốt và đồng đều (Hình 3.9). Song song, với nhân giống các dòng chuyển gen, dòng bạch đàn Urô từ hạt không chuyển gen được nhân giống làm đối chứng âm.
Hình 3.9. Các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 ở chu kì nhân giống thứ 5 Ghi chú: Từ trái qua phải là các dòng: E-X7, E-X16, E-X20, E-X17, E-X29
Các cụm chồi hữu hiệu của mỗi dòng ở chu kì 5 được cắt thành các chồi đơn và cấy chuyển sang môi trường ra rễ chọn lọc có 75 mg/l kanamycin. Kết quả cho thấy tỷ lệ ra rễ của 5 dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 trên môi trường chọn lọc có 75 mg/l kanamycin xấp xỉ 100%, ngược lại, các cây bạch đàn không chuyển gen làm đối chứng âm không thể ra rễ trên môi trường này. Qua đây có thể thấy, các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 vẫn giữ được sự sinh trưởng ổn định qua các chu kì nhân giống vô tính trên môi trường chứa kháng sinh chọn lọc kanamycin.
Bên cạnh việc đánh giá mức độ ổn định của các dòng bạch đàn Urô chuyển gen trên môi trường tái sinh và môi trường ra rễ chứa nồng độ kháng sinh chọn lọc kanamycin lần lượt là 150 mg/l và 75 mg/l sau nhiều chu kì nhân giống vô tính, thì việc kiểm tra sự có mặt của gen chuyển sau các chu kì nhân giống này là rất cần thiết. Để kiểm tra sự có mặt của gen chuyển trong 5 dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 sau 5 chu kì nhân giống, tiến hành lấy mẫu lá 5 dòng này (ký hiệu: E-X7, E-X16, E-X17, E-X20, E-X29) và 1 dòng cây không chuyển gen (ký hiệu: wt) làm đối chứng âm. Mỗi dòng cắt khoảng 100 mg lá bánh tẻ làm mẫu tách chiết DNA tổng số. DNA tổng số lượng nhỏ được tách theo hướng dẫn kỹ thuật của Bộ kít (Plant DNA Isolation Kít, hãng Norgen - Canada).
DNA tổng số sau khi tách chiết được định tính bằng kỹ thuật điện di trên gel agarose 0,8%. Kết quả tách chiết DNA tổng số từ mẫu lá bánh tẻ bạch đàn Urô được thể hiện trên ảnh điện di đồ (Hình 3.10). Trên hình ảnh điện di thu được kết quả băng DNA tổng số thu được một số mẫu chỉ có một phân đoạn duy nhất, đều, gọn, tập trung, không xuất hiện vệt sáng phía sau kéo dài, phân tử lượng cao (nằm gần giếng tra mẫu). Điều đó cho thấy các mẫu DNA tách chiết được không bị đứt gãy, có độ nguyên vẹn cao, không lẫn protein, các loại RNA và các tạp chất khác. Một số mẫu, ngoài việc thu được băng DNA có kích thước lớn nằm trên cùng, các mẫu DNA xuất hiện các đoạn DNA nhỏ đứt gãy; tỷ lệ OD260nm/OD280nm có giá trị 1,8 – 2,0; chất lượng DNA thu được đảm bảo đủ tiêu chuẩn để thực hiện phản ứng PCR nhân gen.
Hình 3.10. DNA tổng số các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 tách chiết ở chu kì 5 trên gel agarose 0,8%.
Các mẫu DNA tổng số tách chiết từ 5 dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1
và cây đối chứng không chuyển gen (ký hiệu: wt) được sử dụng làm khuôn DNA
trong phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu nhân một đoạn gen GS1 + NOS - T có kích thước 499 bp (GS1-qF2: 5’ - ACG AGA CAG CAG ACA TGA ATA CC - 3’ và NOS-R2: 5’- GTT TTC CCA GTC ACG ACG TTG - 3’).
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5%; kết quả thu được cho thấy rằng: Trong 5 dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 nhân giống vô tính đến chu kỳ 5 xuất hiện một băng DNA có kích thước 499 bp so với thang DNA chuẩn 100 bp, rõ nét, bằng với mẫu đối chứng dương (khuôn là vector pBI121-GS1), mẫu wt đối chứng âm (cây không chuyển gen) không có xuất hiện băng DNA này (Hình 3.11). Kết quả này, cho thấy 5 dòng bạch đàn Urô chuyển gen nhân giống vô tính đến chu kỳ 5 vẫn mang gen chuyển (gen GS1).
Hình 3.11. Sản phẩm PCR nhân đoạn gen GS1 + NOS -T từ các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1.
Ghi chú: M - thang DNA chuẩn 100 bp; P - đối chứng dương (pBI121-GS1); wt – cây không chuyển gen; đường chạy từ 1-5 tương ứng với các dòng E-X7, E-
X16, E-X17, E-X20, E-X29.
Bên cạnh việc kiểm tra sự có mặt của gen mục tiêu GS1 sau 5 chu kì nhân giống vô tính, gen nptII cũng được kiểm tra bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi đặc hiệu (NPTII-F: 5’-GAG GCT ATT CGG CTA TGA CTG-3’ và NPTII-R: 5’-ATC GGG AGC GGC GAT ACC GTA-3’). Kết quả thu được cho thấy cả 5 dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 xuất hiện một băng DNA có kích thước khoảng 700 bp so với thang DNA chuẩn 100 bp, rõ nét, bằng với mẫu đối chứng dương (P). Dòng wt đối chứng âm không có xuất hiện băng DNA này (Hình 3.12). Kết quả này một lần nữa khẳng định 5 dòng bạch đàn
M P wt 1 2 3 4 5 500 bp
Urô chuyển gen GS1 nhân giống vô tính đến chu kỳ thứ 5 vẫn mang gen chuyển (gen GS1 và nptII).
Hình 3.12. Sản phẩm PCR nhân đoạn gen nptII từ các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1.
Ghi chú: M - thang DNA chuẩn 100 bp; P - đối chứng dương (pBI121-GS1); wt – cây không chuyển gen; đường chạy từ 1-5 tương ứng với các dòng E-X7, E-
X16, E-X17, E-X20, E-X29.
Ngoài việc kiểm tra gen mục tiêu (gen GS1), gen chọn lọc (gen nptII), để khẳng định các dòng bạch đàn Urô chuyển gen (E-X7, E-X16, E-X17, E-X20, E- X29) vẫn mang đầy đủ cấu trúc gen chuyển qua các chu kỳ nhân giống. Trong nghiên cứu này, cặp mồi đặc hiệu p35S-cf3: 5’- CCA CGT CTT CAA AGC AAG TGG-3’/p35S-cr4: 5’- TCC TCT CCA AAT GAA ATG AAC TTC C -3’ được sử dụng để nhân một đoạn khởi động 35S-Promoter có kích thước khoảng 123 bp và cặp mồi HA-nos-f: 5’-GCA TGA CGT TAT TTA TGA GAT GGG- 3’/HA-nos-r: 5’-GAC ACC GCG CGC GAT AAT TTA TCC-3’ để nhân một đoạn trình tự kết thúc NOS-T có kích thước khoảng 118 bp.
Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 2%. Kết quả cũng cho thấy 5 dòng bạch đàn Urô chuyển gen xuất hiện một băng DNA có kích thước khoảng 123 bp và 118 bp so với thang DNA chuẩn 100 bp, đậm, rõ nét và bằng với mẫu đối chứng dương (P). Trong khi đó, mẫu wt không có xuất hiện băng DNA này (Hình 3.13). Kết quả này khẳng định 5 dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 phân tích sau 5 chu kì nhân giống vô tính vẫn mang đầy đủ cassette gen chuyển (LB-NOS-P-nptII-NOS-T/35S-P-GS1-NOS-T- RB).
M P wt 1 2 3 4 5 700 bp
Hình 3.13. Sản phẩm PCR nhân đoạn 35S-Promoter và NOS-T từ các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1 nhân giống vô tính ở CK5.
Ghi chú: M - thang DNA chuẩn 100 bp; P: đối chứng dương (pBI121-GS1); wt: cây không chuyển gen; đường chạy từ 1-5 tương ứng với mẫu E-X7, E-X16, E-
X17, E-X20, E-X29.; A - nhân 35S-promoter; B - Nhân NOS-T.