Các thể nhận gen (bao gồm lá mầm và thân mầm bạch đàn Urô) sau khi nhiễm khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang cấu trúc vector chuyển gen GS1
được rửa khuẩn bằng dung dịch kháng sinh cefotaxim 400 mg/l và đặt lên môi trường tái sinh chọn lọc lần 1 trên môi trường (Km-EU3 cho mảnh lá mầm và Km-EU4cho đoạn thân mầm) có bổ sung 150 mg/l kanamycin. Sau 3 tuần, xuất hiện các chồi/cụm chồi nhỏ ở mép mảnh lá/đoạn thân, tách các chồi cấy sang môi trường tái sinh chọn lọc mới (lần 2, 3) trên môi trường nhân chồi (Km-EU5)
có bổ sung 200 mg/l kanamycin, nuôi trong 3 tuần. Các chồi sống sót sau 3 lần chọn lọc được cấy lên môi trường ra rễ Km-EU6 có 75 mg/l kanamycin.
Các môi trường điều chỉnh pH 5,8 và khử trùng ở 118oC trong 20 phút. Các vật liệu nghiên cứu nuôi ở chế độ chiếu sáng 3.000 lux, 16h/ngày và nhiệt độ 25 ± 2oC, sau 3 - 4 tuần.
Bảng 2.1. Thành phần các môi trường sàng lọc chồi bạch đàn Urô chuyển gen GS1
trên môi trường kháng sinh chọn lọc in vitro
Loại môi trường Thành phần môi trường
Môi trường chọn lọc lần 1 với thể nhận gen là lá mầm
Km-EU3: MS cơ bản giảm 1/2 nitơ tổng số + 1 mg/l BAP + 0,5 mg/l NAA + 100 ml/l nước dừa (dừa bánh tẻ) + 20 g/l sucrose + 2 g/l phytagel + 400 mg/l cefotaxime + 150 mg/l kanamycin, pH = 5,8.
Môi trường chọn lọc lần 1 với thể nhận gen là thân mầm
Km-EU4: MS cơ bản giảm 1/2 nitơ tổng số + 0,5 mg/l BAP + 0,2 mg/l NAA + 100 ml/l nước dừa (dừa bánh tẻ) + 20 g/l sucrose + 2 g/l phytagel + 400 mg/l cefotaxime + 150 mg/l kanamycin, pH = 5,8.
Môi trường chọn lọc lần 2, 3
Km-EU5: MS giảm ½ nitơ tổng số + 85 mg/l NaH2PO4 + 0,3 mg/l BAP + 0,1 mg/l IBA + 0,05 mg/l NAA + 0,3 mg/l vitamin B2 + 0,05 mg/l axít folic + 20 g/l sucrose + 2 g/l phytagel + 400 mg/l cefotaxime + 200 mg/l kanamycin, pH = 5,8.
Môi trường chọn lọc cây chuyển gen giai đoạn ra rễ
Km-EU6: ½ MScơ bản giảm ½ nitơ tổng số bổ sung 0,3 mg/l NAA + 0,2 mg/l IBA + 20 g/l sucrose + 8 g/l agar + 300 mg/l cefotaxime + 75 mg/l kanamycin, pH = 5,8.
2.3.2. Đánh tính kháng kháng sinh Kanamycin của các dòng cây bạch đàn Urô chuyển gen GS1 trồng ở nhà lưới
- Đánh giá mức độ thiệt hại do kháng sinh kanamycin gây ra cho cây bạch đàn Urô không chuyển gen: Pha kháng sinh kanamycin với hàm lượng 0; 500; 1.000; 1.500 và 2.000 mg/ml. Cắt giấy thấm vô trùng thành miếng có kích thước 1 x 1cm. Cho giấy thấm vào ống chứa dung dịch kanamycin (các hàm lượng khác nhau) sao cho giấy ngập chìm trong dịch kháng sinh và thấm đẫm kháng sinh. Ở nồng độ kanamycin 0 mg/l được sử dụng làm đối chứng, các mảnh giấy được ngâm vào ống chứa nước cất vô trùng. Dùng panh kẹp giấy thấm đặt lên trên bề mặt cặp lá thứ 3 từ ngọn xuống của cây bạch đàn không chuyển gen (Ký hiệu: wt); mỗi lá đặt 1-2 miếng giấy thấm kháng sinh kanamycin. Sau 2 ngày, miếng giấy thấm kháng sinh kanamycin khô, ta lấy bỏ đi và thống kê mức độ thiệt hại do kháng sinh kanamycin gây ra sau 5; 10 và 15 ngày thí nghiệm. Từ kết quả thu được tìm được nồng độ kanamycin và thời gian đánh giá tính kháng kháng sinh phù hợp cho các dòng bạch đàn Urô chuyển gen GS1.
- Đánh giá tính kháng kháng sinh kanamycin của các dòng cây bạch đàn Urô chuyển gen GS1 trồng ở nhà lưới: Sử dụng phương pháp đánh giá giống như đánh giá mức độ thiệt hại do kháng sinh kanamycin gây ra cho cây bạch đàn Urô không chuyển gen với nồng độ kháng sinh và thời gian đánh giá đã tìm được ở trên.
(Phương pháp tham khảo từ Phòng công nghệ tế bào thực vật – Viện Công nghệ sinh học, đã áp dụng đánh giá tính kháng kanamycin trên cây đu đủ, bông, khoai lang, v.v. ở nhà lưới).