Bảng 13: Nồng độ HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân viêm gan B mạn tính ở nhóm HBeAg dương tính và âm tính.
HBV RNA HBeAg HBV RNA(- ) n(%) HBV RNA(+) n(%) Giá trị trung bình (log10 copies/mL) ≥ 5log10 copies/mL ˂ 5log10 copies/mL Dương tính (n= 63) 21/63 (33,33%) 23 (36,51%) 19 (30,16%) 5,21 ± 1,97 Âm tính (n= 14) 7/14 (50,00%) 0 (0,00%) 7 (50,00%) 1,80 ± 1,42 Chung (n= 77) 28/77 (36,36%) 49/77 (63,64%) 4,72 ± 2,24 P 0,241 > 0,05(1) 0,000(2)
1)Kiểm định theo thuật toán thống kế Chi-square
(2 )Kiểm định theo thuật toán thống kế One –Way ANOVA
Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy HBV pgRNA định lượng được ở 49 trong số 77 bệnh nhân CHB (63,64%) ở nồng độ trung bình là 4,72 ± 2,24 log10 copy/ml. Kết quả này của chúng tôi tương đương với kết luận trong nghiên cứu của nhóm tác giả Florian van Bommel về nồng độ HBV pgRNA huyết tương ở bệnh nhân CHB,
nghiên cứu trên 62 bệnh nhân CHB cho thấy nồng độ HBV pgRNA trung bình là 5,2 ± 1,6 log10 IU/mL (tương đương 5,9 ± 2,3 log10 copy/mL) [110]. Tương tự, nghiên cứu của Jie Wang (2016) xác định được nồng độ HBV pgRNA huyết tương trung bình là 6,31 (5,10–8,02) log10 copy/ml [114]. Tác giả Yi-Wen Huang (2015) nghiên cứu trên 52 bệnh nhân CHB trước khi điều trị bằng lamivudin thấy HBV pgRNA định lượng được ở 21/52 (40,38%) bệnh nhân với nồng độ trung bình 5,2 log10 copy/ml (ngưỡng phát hiện dưới của xét nghiệm sử dụng là 2,2 log10 copy/mL)
[42]. Kết quả chúng tôi cho thấy tỷ lệ bệnh nhân định lượng được HBV pgRNA huyết tương thấp hơn so với nghiên cứu của tác giả Yi-Wen Huang. Điều này là do sự khác biệt về thiết kế của xét nghiệm sử dụng trong nghiên cứu giữa hai nghiên cứu với vùng gen tương ứng sử dụng cho thiết kế mồi đặc hiệu khác nhau. Đồng thời, hai nghiên cứu tiến hành trên hai nhóm đối tượng khác nhau về nhiều đặc điểm như địa lý, dân tộc... Tác giả Jing Wang (2017) ghi nhận nồng độ HBV pgRNA huyết tương trung bình ở 35 bệnh nhân CHB là 3,02 log10 copy/mL. Kết quả này tương đối thấp so với kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng như các nghiên cứu khác do đối tượng nghiên cứu của tác giả là các bệnh nhân đã được điều trị bằng entecavir trong thời gian 1-10 năm [45]. Nguyên nhân là do các thuốc NA ức chế sự tổng hợp ADN virus nhưng không hoặc rất ít có tác dụng lên quá trình tổng hợp pgRNA từ khuôn cccDNA, do đó nó vẫn được tiếp tục sản xuất và tiết ra huyết tương. Trong quá trình điều trị, nồng độ HBV RNA huyết tương giảm chậm hơn rất nhiều so với HBV DNA và có thể định lượng được kể cả khi nồng độ HBV DNA huyết tương đã đạt dưới ngưỡng phát hiện. Nồng độ HBV pgRNA huyết tương giảm rõ rệt thường được thấy ở các bệnh nhân được điều trị bằng NA liên tục từ 1 năm trở lên. Trong nhóm bệnh nhân nghiên cứu của tác giả Jing Wang, việc điều trị trong thời gian dài là một nguyên nhân cơ bản làm nồng độ HBV pgRNA huyết tương định lượng được thấp hơn nhiều so với nghiên cứu của chúng tôi (trên các bệnh nhân chưa điều trị kháng virus).
Trong nghiên cứu của chúng tôi, giá trị trung bình nồng độ HBV pgRNA trên phân nhóm CHB có HBeAg (+) cao hơn so với phân nhóm CHB có HBeAg (-)
(5,21 ± 1,97 log10 copy/mL so với 1,80 ± 1,42 log10 copy/mL), sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (p <0,05).Cho đến nay, các nghiên cứu chủ yếu đánh giá trên nhóm đối tượng CHB có HBeAg (+), trong khi đó, việc đánh giá HBV pgRNA huyết tương ở nhóm bệnh nhân HBeAg(-) vẫn còn hạn chế. Nghiên cứu của Florian van Bommel (2015) cũng nhận thấy có sự khác biệt tương tự về nồng độ HBV pgRNA giữa hai nhóm bệnh nhân CHB, HBeAg (+), HBeAg (-) là 4,9 ±1,3 log10 IU/mL (5,6 ± 2,0 log10 copy/mL) so với 4,3 ± 1,4 log10IU/mL (5,0 ± 2,1 log10 copy/mL) [110]. Tuy nhiên sự khác biệt trong nghiên cứu của Florian van Bommel không có ý nghĩa thống kê (p >0,05). M.J. van Campenhout tiến hành nghiên cứu trên 274 bệnh nhân CHB có HBeAg (+) ghi nhận nồng độ HBV pgRNA trung bình là 6,5 ± 1,2 log10IU/l (7,2 ± 1,9 log10 copies/mL) [66]. Tương tự, nồng độ HBV pgRNA huyết tương được xác định trong một nghiên cứu của khác của M.J. van Campenhout với sự tham gia của 175 bệnh nhân CHB, HBeAg (+) là 6,1 ± 1,1 log10IU/l (6,8 ± 1,8 log10 copy/mL) [67]. Như vậy, quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA tương đương với các quy trình định lượng HBV pgRNA trên thế giới hiện nay. Tuy nhiên, để khẳng định độ nhạy vượt trội của quy trình cần thiết phải đánh giá trên số lượng mẫu nhiều hơn, đó là hướng nghiên cứu tiếp theo mà nhóm nghiên cứu sẽ tiến hành.
KẾT LUẬN
1) Thiết kế thành công chứng dương HBV pgRNA in-vitro.
2) Xây dựng và tối ưu thành công quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA:
- Thiết kế thành công bộ mồi, probe đặc hiệu cho HBV pgRNA.
- Tối ưu thành công quy trình RT-qPCR định lượng về thành phần phản ứng và điều kiện phản ứng.
- Ngưỡng phát hiện của quy trình là 80 copy/ml, ngưỡng định lượng của quy trình là 160 copy/ml huyết tương, độ đặc hiệu 100%
3) Quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA có độ chính xác, độ lặp lại tốt; bộ mẫu chuẩn ổn định trong 3 tháng đánh giá.
4) Quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA tương đương với các quy trình định lượng HBV pgRNA trên thế giới.
KIẾN NGHỊ
- Tiếp tục đánh giá quy trình RT-qPCR định lượng HBV RNA trên bệnh nhân viêm gan B mạn tính với cỡ mẫu lớn hơn, đối tượng nghiên cứu mở rộng hơn.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu Tiếng Việt:
1. Trần Ngọc Ánh, 2012, Nồng độ HBsAg, HBV-DNA ở bệnh nhân viêm gan B mạn tính. Tạp chí Nghiên cứu Y học. 2: p. 1-6.
2. Bùi Đại, 2002, Viêm gan virus B và D.
3. Lê Đăng Hà, Đào Đình Đức, Nguyễn Đức Hiền, Trịnh Thị Minh Liên, 1997,
Dịch tễ học viêm gan virút B ở Việt Nam. Tạp chí Y học thực hành. 9: p. 1-3. 4. Võ Triều Lý, Phạm Thị Lệ Hoa, Nguyễn Thị Cẩm Hường, 2015, Giá trị của
HBsAg định lượng để phân biệt người mang HBV không hoạt tính và viêm gan siêu vi B mạn tái hoạt, Tạp chí Y học Tp. Hồ Chí Minh. 19: p. 330-335. 5. Phạm Hoàng Phiệt, Nguyễn Phương Thảo, 2010, Khảo sát mối tương quan
giữa lượng HBsAg với một số kết quả về virus học và lâm sàng trên bệnh nhân viêm gan B mạn tính hoạt động chưa điều trị đặc hiệu. 13: p. 5-13. 6. Hoàng Tiến Tuyên, Nguyễn Hữu Quyền, Nguyễn Văn Diễn, 2017, Tìm hiểu
mối tương quan giữa hàm lượng HBsAg với tải lượng virut và hoạt độ ALT ở bệnh nhân viêm gan virut B mạn tính, Tạp chí Y Dược học Quân sự. 2: p. 126-131.
Tài liệu Tiếng Anh:
7. L. Allweiss and M. Dandri, 2017, The Role of cccDNA in HBV Maintenance,
Viruses. 9(6).
8. N. M. Araujo, 2015, Hepatitis B virus intergenotypic recombinants worldwide: An overview, Infect Genet Evol. 36: p. 500-510.
9. R. Bartenschlager and H. Schaller, 1988, The amino-terminal domain of the hepadnaviral P-gene encodes the terminal protein (genome-linked protein) believed to prime reverse transcription, EMBO J. 7(13): p. 4185-92.
10. R. Bartenschlager, M. Junker-Niepmann and H. Schaller, 1990, The P gene product of hepatitis B virus is required as a structural component for genomic RNA encapsidation, J Virol. 64(11): p. 5324-32.
11. T. F. Baumert, L. Meredith, Y. Ni, D. J. Felmlee, J. A. McKeating and S. Urban, 2014, Entry of hepatitis B and C viruses - recent progress and future impact, Curr Opin Virol. 4: p. 58-65.
12. R. P. Beasley, 1988, Hepatitis B virus. The major etiology of hepatocellular carcinoma, Cancer. 61(10): p. 1942-56.
13. L. Belloni, T. Pollicino, F. De Nicola, F. Guerrieri, G. Raffa, M. Fanciulli, et al., 2009, Nuclear HBx binds the HBV minichromosome and modifies the epigenetic regulation of cccDNA function, Proc Natl Acad Sci U S A.
106(47): p. 19975-9.
14. F. Bernard, G. Raymond, B. Willems and J. P. Villeneuve, 1997,
Quantitative assessment of serum hepatitis B e antigen, IgM hepatitis B core antibody and HBV DNA in monitoring the response to treatment in patients with chronic hepatitis B, J Viral Hepat. 4(4): p. 265-72.
15. A. Bertoletti and A. J. Gehring, 2013, Immune therapeutic strategies in chronic hepatitis B virus infection: virus or inflammation control?, PLoS Pathog. 9(12): p. e1003784.
16. F. Birnbaum and M. Nassal, 1990, Hepatitis B virus nucleocapsid assembly: primary structure requirements in the core protein, J Virol. 64(7): p. 3319- 30.
17. T. M. Block, H. Guo and J. T. Guo, 2007, Molecular virology of hepatitis B virus for clinicians, Clin Liver Dis. 11(4): p. 685-706, vii.
18. Florian Bömmel, Anne Bartens, Alena Mysickova, Jörg Hofmann, Detlev H Krüger, Thomas Berg, et al., 2015, Serum hepatitis B virus RNA levels as an
early predictor of hepatitis B envelope antigen seroconversion during treatment with polymerase inhibitors, Hepatology. 61(1): p. 66-76.
19. S. Bonhoeffer and P. Sniegowski, 2002, Virus evolution: the importance of being erroneous, Nature. 420(6914): p. 367, 369.
20. R. Bonilla Guerrero and L. R. Roberts, 2005, The role of hepatitis B virus integrations in the pathogenesis of human hepatocellular carcinoma, J Hepatol. 42(5): p. 760-77.
21. C. Brechot, M. Hadchouel, J. Scotto, M. Fonck, F. Potet, G. N. Vyas, et al., 1981, State of hepatitis B virus DNA in hepatocytes of patients with hepatitis B surface antigen-positive and -negative liver diseases, Proc Natl Acad Sci U S A. 78(6): p. 3906-10.
22. C. Brechot, D. Kremsdorf, P. Paterlini and V. Thiers, 1991, Hepatitis B virus DNA in HBsAg-negative patients. Molecular characterization and clinical implications, J Hepatol. 13 Suppl 4: p. S49-55.
23. C. Brechot, 2004, Pathogenesis of hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma: old and new paradigms, Gastroenterology. 127(5 Suppl 1): p. S56-61.
24. M. R. Brunetto, 2010, A new role for an old marker, HBsAg, J Hepatol.
52(4): p. 475-7.
25. V. Bruss, 2004, Envelopment of the hepatitis B virus nucleocapsid, Virus Res. 106(2): p. 199-209.
26. C. J. Chu, M. Hussain and A. S. Lok, 2002, Quantitative serum HBV DNA levels during different stages of chronic hepatitis B infection, Hepatology.
36(6): p. 1408-15.
27. Jacobson I Colucci G, Lalatta F, Vernance S, Waksal SD, Weksler ME, 1986, Detection of hepatitis B virus DNA, RNA and surface antigen in mononuclear cells from patients with type B hepatitis, Clin Res.
28. D. S. Dane, C. H. Cameron and M. Briggs, 1970, Virus-like particles in serum of patients with Australia-antigen-associated hepatitis, Lancet.
1(7649): p. 695-8.
29. S. Datta, 2008, An overview of molecular epidemiology of hepatitis B virus (HBV) in India, Virol J. 5: p. 156.
30. E. C. Doo and M. G. Ghany, 2010, Hepatitis B virology for clinicians, Clin Liver Dis. 14(3): p. 397-408.
31. C. Dunn, D. Peppa, P. Khanna, G. Nebbia, M. Jones, N. Brendish, et al., 2009, Temporal analysis of early immune responses in patients with acute hepatitis B virus infection, Gastroenterology. 137(4): p. 1289-300.
32. Liver European Association For The Study Of The, 2012, EASL clinical practice guidelines: Management of chronic hepatitis B virus infection, J Hepatol. 57(1): p. 167-85.
33. S. Ezzikouri, M. Ozawa, M. Kohara, N. Elmdaghri, S. Benjelloun and K. Tsukiyama-Kohara, 2014, Recent insights into hepatitis B virus-host interactions, J Med Virol. 86(6): p. 925-32.
34. D. Ganem and A. M. Prince, 2004, Hepatitis B virus infection--natural history and clinical consequences, N Engl J Med. 350(11): p. 1118-29.
35. W. H. Gerlich, 2013, Medical virology of hepatitis B: how it began and where we are now, Virol J. 10: p. 239.
36. J. R. Gu, Y. C. Chen, H. Q. Jiang, Y. L. Zhang, S. M. Wu, W. L. Jiang, et al., 1985, State of hepatitis B virus DNA in leucocytes of hepatitis B patients, J Med Virol. 17(1): p. 73-81.
37. S. Gunther, 2006, Genetic variation in HBV infection: genotypes and mutants, J Clin Virol. 36 Suppl 1: p. S3-S11.
38. Pasquinelli C Hadchouel M, Fournier JG, 1988, Detection of mononuclear cells expressing hepatitis B virus in peripheral blood from HBsAg positive and negative patients by situ hybridization: p. 27–123.
39. T. Hatakeyama, C. Noguchi, N. Hiraga, N. Mori, M. Tsuge, M. Imamura, et al., 2007, Serum HBV RNA is a predictor of early emergence of the YMDD mutant in patients treated with lamivudine, Hepatology. 45(5): p. 1179-86. 40. R. A. Heijtink, J. Kruining, P. Honkoop, M. C. Kuhns, W. C. Hop, A. D.
Osterhaus, et al., 1997, Serum HBeAg quantitation during antiviral therapy for chronic hepatitis B, J Med Virol. 53(3): p. 282-7.
41. Y. W. Huang, K. Chayama, M. Tsuge, S. Takahashi, T. Hatakeyama, H. Abe, et al., 2010, Differential effects of interferon and lamivudine on serum HBV RNA inhibition in patients with chronic hepatitis B, Antivir Ther. 15(2): p. 177-84.
42. Y. W. Huang, S. Takahashi, M. Tsuge, C. L. Chen, T. C. Wang, H. Abe, et al., 2015, On-treatment low serum HBV RNA level predicts initial virological response in chronic hepatitis B patients receiving nucleoside analogue therapy, Antivir Ther. 20(4): p. 369-75.
43. L. Jansen, N. A. Kootstra, K. A. van Dort, R. B. Takkenberg, H. W. Reesink and H. L. Zaaijer, 2016, Hepatitis B Virus Pregenomic RNA Is Present in Virions in Plasma and Is Associated With a Response to Pegylated Interferon Alfa-2a and Nucleos(t)ide Analogues, J Infect Dis. 213(2): p. 224-32.
44. Jerzy Jaroszewicz, Beatriz Calle Serrano, Karsten Wursthorn, Katja Deterding, Jerome Schlue, Regina Raupach, et al., 2010, Hepatitis B surface antigen (HBsAg) levels in the natural history of hepatitis B virus (HBV)- infection: a European perspective, Journal of hepatology. 52(4): p. 514-522.
45. Yiqi Yu Jing Wang, Guojun Li, et al., , 2017, Relationship between serum HBV RNA levels and intrahepatic viral as well as histologic activity markers in entecavir-treated patients, Journal of Hepatology.
46. Venetia Saunders John Carter, Viriology - Principles and Applications. 2007. 47. M. Kann, A. Schmitz and B. Rabe, 2007, Intracellular transport of hepatitis
B virus, World J Gastroenterol. 13(1): p. 39-47.
48. P. M. Kaplan, R. L. Greenman, J. L. Gerin, R. H. Purcell and W. S. Robinson, 1973, DNA polymerase associated with human hepatitis B antigen, J Virol. 12(5): p. 995-1005.
49. P. Karayiannis, 2017, Hepatitis B virus: virology, molecular biology, life cycle and intrahepatic spread, Hepatol Int. 11(6): p. 500-508.
50. M. Karimova, N. Beschorner, W. Dammermann, J. Chemnitz, D. Indenbirken, J. H. Bockmann, et al., 2015, CRISPR/Cas9 nickase-mediated disruption of hepatitis B virus open reading frame S and X, Sci Rep. 5: p. 13734.
51. A. Kay and F. Zoulim, 2007, Hepatitis B virus genetic variability and evolution, Virus Res. 127(2): p. 164-76.
52. K. Kidd-Ljunggren, Y. Miyakawa and A. H. Kidd, 2002, Genetic variability in hepatitis B viruses, J Gen Virol. 83(Pt 6): p. 1267-80.
53. S. Kim, J. Lee and W. S. Ryu, 2009, Four conserved cysteine residues of the hepatitis B virus polymerase are critical for RNA pregenome encapsidation,
J Virol. 83(16): p. 8032-40.
54. A. Kramvis, 2014, Genotypes and genetic variability of hepatitis B virus,
Intervirology. 57(3-4): p. 141-50.
55. J. P. Lamelin and C. Trepo, 1990, The hepatitis B virus and the peripheral blood mononuclear cells: a brief review, J Hepatol. 10(1): p. 120-4.
56. Daniel Lavanchy and Mark Kane, Global epidemiology of hepatitis B virus infection, in Hepatitis B Virus in Human Diseases. 2016, Springer. p. 187- 203.
57. H. C. Li, E. Y. Huang, P. Y. Su, S. Y. Wu, C. C. Yang, Y. S. Lin, et al., 2010, Nuclear export and import of human hepatitis B virus capsid protein and particles, PLoS Pathog. 6(10): p. e1001162.
58. T. J. Liang, 2009, Hepatitis B: the virus and disease, Hepatology. 49(5 Suppl): p. S13-21.
59. Y. F. Liaw, J. J. Sung, W. C. Chow, G. Farrell, C. Z. Lee, H. Yuen, et al., 2004, Lamivudine for patients with chronic hepatitis B and advanced liver disease, N Engl J Med. 351(15): p. 1521-31.
60. Yun-Fan Liaw and Chia-Ming Chu, 2009, Hepatitis B virus infection, The Lancet. 373(9663): p. 582-592.
61. S. Locarnini, M. Littlejohn, M. N. Aziz and L. Yuen, 2013, Possible origins and evolution of the hepatitis B virus (HBV), Semin Cancer Biol. 23(6 Pt B): p. 561-75.
62. A. S. Lok, E. J. Heathcote and J. H. Hoofnagle, 2001, Management of hepatitis B: 2000--summary of a workshop, Gastroenterology. 120(7): p. 1828-53.
63. A. S. Lok and B. J. McMahon, 2009, Chronic hepatitis B: update 2009,
Hepatology. 50(3): p. 661-2.
64. J. Lucifora, S. Arzberger, D. Durantel, L. Belloni, M. Strubin, M. Levrero, et al., 2011, Hepatitis B virus X protein is essential to initiate and maintain virus replication after infection, J Hepatol. 55(5): p. 996-1003.
65. L. Ludgate, X. Ning, D. H. Nguyen, C. Adams, L. Mentzer and J. Hu, 2012,