3.2. Tối ưu quy trình realtime RT-PCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết
3.2.1. Tối ưu điều kiện phản ứng bao gồm: nhiệt độ gắn mồi, thời gian các
và tốc dộ thay đổi nhiệt độ của phản ứng của phản ứng RT-qPCR.
Tối ưu nhiệt độ gắn mồi bước phiên mã ngược:
Kết quả của quy trình phiên mã ngược được thực hiện ở 45℃ trong vòng 10 phút sẽ được trình bày dưới đây:
Hình 12: Kết quả của phản ứng RT-qPCR trên phần mềm RotorGene với nhiệt độ 45℃.
45.1 và 45.2: hai mẫu chuẩn dương S4 và S5 được phiên mã ngược ở nhiệt độ 45°C trong khoảng thời gian 10 phút. 45 E- là mẫu không bổ sung enzyme RTase và 45 NTC là mẫu chứng âm
của phản ứng này
Kết quả của quy trình phiên mã ngược được thực hiện ở nhiệt độ 50°C trong vòng 10 phút sẽ được trình bày dưới đây:
Hình 13: Kết quả của phản ứng RT-qPCR trên phần mềm RotorGene với nhiệt độ 50°C.
50.1 và 50.2 là hai mẫu chuẩn dương S4 và S5 với thứ tự các mẫu giống như mẫu 45.1 và 45.2 và được phiên mã ngược ở nhiệt độ 50°C trong khoảng thời gian 10 phút. 50 E- là mẫu không
bổ sung enzyme RTase và 50 NTC là mẫu chứng âm của phản ứng này.
Như vậy, theo như kết quả so sánh với hai nhiệt độ ở bước phiên mã ngược khác nhau, nhóm nghiên cứu nhận thấy Ct value ở nhiệt độ bước phiên mã ngược 50°C sớm hơn giá trị Ct ở nhiệt độ 45°C khoảng 1-2 chu kỳ. Hơn nữa, nếu nhìn vào chu kỳ khuếch đại, tín hiệu khuếch đại ở nhiệt độ 50°C cho thấy hiệu suất khuếch đại tốt hơn, đường tín hiệu cao hơn ở nhiệt độ 45°C. Không chỉ ở hai mẫu này mà khảo sát trên một số mẫu bệnh nhân CHB cũng cho thấy kết quả như vậy. Bên cạnh đó, mẫu chứng âm enzyme không cho thấy phản ứng không có lẫn HBV DNA, và như vậy quá trình tách chiết và xử lý sau tách chiết đã loại hết HBV DNA, điều đó giúp quá trình định lượng không bị ảnh hưởng. Mẫu chứng âm nước cũng không có tín hiệu khuếch đại, chứng tỏ phản ứng có độ đặc hiệu tốt.
Như vậy, nhiệt độ tối ưu cho bước phiên mã ngược RNA của quy trình định lượng là nhiệt độ 50°C.
Tối ưu thời gian bước phiên mã ngược
Kết quả của quy trình phiên mã ngược được thực hiện ở nhiệt độ 50°C trong vòng 10 phút thể hiện qua hình 13:
Kết quả của quy trình phiên mã ngược được thực hiện ở nhiệt độ 50°C trong vòng 20 phút như sau:
Hình 14: Thời gian phiên mã ngược 20 phút.
T20 M2 và T20M1 là hai mẫu chuẩn dương S4 và S5 được phiên mã ngược ở nhiệt độ 50°C trong khoảng thời gian 20 phút. T20 E- là mẫu không bổ sung enzyme RTase và T20 NTC là mẫu chứng
âm của phản ứng này.
Kết quả của quy trình phiên mã ngược được thực hiện ở nhiệt độ 50°C trong vòng 40 phút như sau:
Hình 15: Thời gian phiên mã ngược 40 phút.
T40 M1 và T40 M2 là hai mẫu chuẩn dương S5 và S4 được phiên mã ngược ở nhiệt độ 50°C trong khoảng thời gian 40 phút. T20 E- là mẫu không bổ sung enzyme RTase và T20 NTC là mẫu chứng
âm của phản ứng này.
Với ba hình kết quả hình 13, hình 14, hình 15 tương ứng với từng thời gian phiên mã ngược lần lượt là 10; 20 và 40 phút, nhóm nghiên cứu nhận thấy Ct ở hai mẫu M1 và M2 đều giảm dần khi tăng thời gian phiên mã ngược. Vì vậy, 10 phút chính là khoảng thời gian vừa đủ để phản ứng phiên mã ngược diễn ra, việc tăng thời gian là không cần thiết và có khả năng làm giảm độ nhạy của phản ứng.
Tối ưu nhiệt độ gắn mồi qPCR
Hình 16: Nhiệt độ gắn mồi 63°C.
T1, T2, T6: là các mẫu chuẩn dương RNA S4
Hình 17: Nhiệt độ gắn mồi 57°C.
T1, T2, T6: là các mẫu chuẩn dương RNA S4, AM: mẫu chứng âm
Sau khi khảo sát trên mẫu chuẩn dương S4 nhóm nghiên cứu nhận thấy nhiệt độ gắn mồi 63°C là nhiệt độ tối ưu cho quá trình RT-qPCR. Các giá trị Ct của các tube S5 ở nhiệt độ 63°C đều sớm hơn nhiệt độ 57°C từ 1 - 2 chu kì. Hơn hết, nhiệt độ gắn mồi cao hơn giúp phản ứng PCR đặc hiệu hơn.
Tối ưu thời gian gắn mồi:
Sau đây là kết quả của quá trình tối ưu thời gian gắn mồi trong chu trình luân nhiệt:
Hình 18: Kết quả ở thời gian gắn mồi 15 giây.
T15: Mẫu chuẩn dương S4 với thời gian gắn mồi 15 giây, NTC: mẫu chứng âm
Hình 19: Kết quả ở thời gian gắn mồi 30 giây.
T30: Mẫu chuẩn dương S4 với thời gian gắn mồi 30 giây, NTC: mẫu chứng âm Theo như kết quả so sánh giữa hai thời gian gắn mồi thì với cùng một mẫu, ở thời gian kéo dài là 30 giây cho giá trị Ct sớm hơn 2 chu kỳ, tức là lượng sản phẩm gấp 4 lần, so với thời gian kéo dài 15 giây (29,16 so với 31,71). Như vậy, thời gian