3.2. Tối ưu quy trình realtime RT-PCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết
3.2.2. Tối ưu các thành phần phản ứng RT-PCR, gồm có buffer, các enzyme
DNA polymerase, nồng độ mồi và probe. Thành phần phản ứng bao gồm cả dUTP và AmpErase uracil N-glycosylase để chống ngoại nhiễm.
Tối ưu nồng độ primer:
Kết quả tối ưu nồng độ mồi được trình bày ở hình sau:
Hình 20: Kết quả tối ưu nồng độ mồi.
RNA HBV+: mẫu chứng dương HBV RNA, 1E+: mẫu chứng dương nồng độ mồi 1 µM, 0,5E+, 0,2 E+; 0,1 E+1; 0,1E+2; 0,05E+1; 0,05E+2 lần lượt là các mẫu chứng dương ở các dải nồng độ mồi 0,5; 0,2;0,1; 0,05;-0: mẫu chứng âm; 0,05-: mẫu chứng âm không enzyme nồng độ mồi 0,05.
Như vậy, theo như kết quả RT-qPCR và so sánh dựa trên giá trị Ct, nồng độ mồi 1 và 0,5 µM đều cho giá trị Ct khoảng chu kỳ thứ 29, tuy nhiên nhóm nghiên cứu quyết định lựa chọn nồng độ mồi là 0,5 µM vì sử 1 µM là nồng độ mồi khá cao và có thể ảnh hưởng đến quá trình probe gắn vào trình tự đích do cạnh tranh với mồi trong thành phần phản ứng. Nhất là có nhiệt độ ủ khoảng 50°C ở thời gian đầu càng tạo điều kiện cho mồi gắn vào trước probe.
Theo như kết quả Realtime ở hình 19 và hình 20, nồng độ probe tạo nên sự khác biệt rất lớn trong quy trình định lượng trên cùng một chứng dương. Và do Ct value lên sớm hơn khoảng 3 chu kỳ, nồng độ probe 0,2 µM đã được lựa chọn là nồng độ tối ưu cho quy trình định lượng HBV pgRNA.
Hình 21: Kết quả đánh giá ở nồng độ probe 0,2 µM
P 0,1: Mẫu chứng dương nồng độ probe 0,1, NTC: mẫu chứng âm
P 0,1: Mẫu chứng dương nồng độ probe 0,1; NTC: mẫu chứng âm