P 0,1: Mẫu chứng dương nồng độ probe 0,1; NTC: mẫu chứng âm
3.2.3. Quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA
Sau quá trình tối ưu các thành phần của phản ứng RT-qPCR, nhóm nghiên cứu đã xây dựng thành công bảng thành phần tối ưu của phản ứng RT-qPCR.
Bảng 7: Thành phần tối ưu của một phản ứng RT-qPCR
STT Thành phần Thể tích (µl)
1 Đệm RT-PCR (2X) 10
2 Mồi xuôi (10µM) 1
3 Mồi ngược (10µM) 1
4 Probe (10µM) 0,4
5 Nước đã khử ion DNA/RNase free 1,58
6 Enzyme RTase 0,02
7 RNA template 6
Tổng 20
Sau khi thực hiện quá trình tối ưu các điều kiện trong chu trình nhiệt của phản ứng RT-qPCR ở rất nhiều các khía cạnh như: thời gian cũng như nhiệt độ, nhóm nghiên cứu xin đưa ra bảng tổng kết chu trình nhiệt tối ưu cho phản ứng định lượng tải lượng HBV pgRNA bằng phương pháp RT-qPCR.
Bảng 8: Chu trình luân nhiệt tối ưu của phản ứng RT-qPCR
Steps T° T.gian đ.vị
Hold 50 10 phút
Biến tính 95 15 phút
N° chu kỳ: 45 Gắn mồi 63 30 giây
Kéo dài 72 30 giây
Lưu mẫu trên máy 25 ∞
3.3. Đánh giá chất lượng quy trình RT-qPCR.
3.3.1. Xác định ngưỡng phát hiện, ngưỡng định lượng trong mỗi lần xét nghiệm. Xác định độ chính xác, độ lặp lại giữa các lần xét nghiệm của quy trình RT-PCR Xác định độ chính xác, độ lặp lại giữa các lần xét nghiệm của quy trình RT-PCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB.
Ngưỡng phát hiện, ngưỡng định lượng:
Nhóm nghiên cứu thực hiện đánh giá quy trình RT-qPCR đã được tối ưu dựa vào bộ mẫu chuẩn đã được thiết lập. Trong một lần chạy, các mẫu nồng độ được lặp lại ba lần. Tất cả nồng độ đều được thực hiện đánh giá trong 10 lần chạy và ghi chép lại kết quả, tổng hợp số lần chạy cho tín hiệu khuếch đại có ý nghĩa chia tỉ lệ với tổng số phản ứng để xác định ngưỡng định lượng và ngưỡng phát hiện của quy trình định lượng HBV pgRNA.
Bảng 9: Kết quả đánh giá quy trình định lượng trên dải nồng độ 104 – 1,25 copy/phản ứng trong 10 lần chạy
Nồng độ (copy/phản ứng) Số lần phát hiện/Tổng số phản ứng Tỉ lệ 104 30/30 100 % 103 30/30 100 % 102 30/30 100 % 101 30/30 100 % 5 29/30 97 % 2,5 11/30 37 % 1,25 0/30 0 %
Dựa trên kết quả quá trình đánh giá các mẫu nồng độ thấp 102, 101, và các mẫu pha loãng 2 lần, 4 lần, 8 lần của nồng độ 101 trên phản ứng (Bảng 9), nhóm nghiên cứu nhận thấy ngưỡng định lượng của phản ứng là 101 copy/phản ứng (30/30 lần chạy lặp lại đều cho tín hiệu, tương ứng với tỉ lệ 100%), và mẫu pha loãng 2 lần của mẫu 101 copy/ phản ứng (tức là 5 copy/phản ứng) là ngưỡng phát hiện (29/30 lần lặp lại đều cho tín hiệu, đạt tỉ lệ 97%). Khả năng khuếch đại tốt của cặp mồi cũng như các mẫu chuẩn thiết kế đều đạt chất lượng ổn định trong các lần chạy khác nhau. Độ đặc hiệu được thể hiện qua chứng không có mẫu chuẩn (chứng âm) đạt tỉ lệ 100%, chứng tỏ độ đặc hiệu của quy trình tốt, có tính ổn định cao.
Khi nhân với hệ số cô đặc của quá trình tách chiết là 10, thì ngưỡng phát hiện của phản ứng RT-qPCR là 80 copy/mL huyết tương, ngưỡng định lượng là 160 copy/mL huyết tương.
Đô chính xác, độ lặp lại của quy trình:
Để xác định các thông số về chất lượng của phản ứng Realtime PCR được nhóm thiết lập, các sản phẩm gồm chứng dương, chứng âm và bộ mẫu chuẩn với dải nồng độ xác định được thiết lập với mẫu chuẩn là chứng dương pgRNA HBV được tạo ra qua quá trình tổng hợp RNA in-vitro dựa trên trình tự HBV DNA ở Việt Nam. Kết quả chạy đánh giá quy trình RT-PCR được trình bày ở hình sau: