2.2. 1 Thiết kế nghiên cứu
2.2.4. Xây dựng quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA huyết tương
a) Thiết kế trình tự mồi và probe cho phản ứng RT-qPCR đo tải lượng HBV-RNA trong huyết tương bệnh nhân CHB.
Xác định được vùng bảo tồn là vùng gen S (kích thước khoảng 1200 nu, vùng N-terminal là vùng bảo tồn hơn cả (đã chứng minh ở phần tổng quan), vùng này được đánh dấu để thiết kế mồi, probe. Bước tiếp theo là đánh giá tính đa hình, đột
biến của vùng này để tìm ra vùng trình tự cụ thể cho thiết kế mồi/probe sử dụng phần mềm Clustalx.
Hình 5: Đánh giá tính đa hình, đột biến vùng gen S
Sau đó, các trình tự thích hợp trên GenBank được thu thập để thiết kế mồi và probe, đó là trình tự phổ biến nhất tại Việt Nam có tính đại diện, trình tự này phải được công bố bởi một nhóm nghiên cứu uy tín, kết quả giải trình tự đáng tin cậy. Lựa chọn vùng bảo thủ nhất thuộc đầu N-terminal gen S của trình tự đã lựa chọn để thiết kế mồi sử dụng phần mềm Oligo Primer Analysis Software (Molecular Biology Insights, Hoa Kỳ- http://www.oligo.net/index.html). Đây là phần mềm chuyên dụng trong thiết kế các mồi/probe tối ưu dùng trong các kỹ thuật khuếch đại gen.
Các ứng dụng BLAST, primer3 được sử dụng để đánh giá các tiêu chí có thể gây ảnh hưởng đến tính đặc hiệu và hiệu suất của quá trình RT-qPCR, bao gồm: nhiệt độ gắn mồi, % GC, %AT, khả năng xảy ra bắt cặp nhầm và tạo dimer,vv.
Những điểm cần chú ý khi thiết kế mồi/probe:
Thiết kế mồi cho real-time PCR dùng Taqman probe cũng theo các quy luật thiết kế mồi chung cho PCR. Trong real-time PCR dùng Taqman probe thì nên thiết kế mồi có nhiệt độ nóng chảy khoảng 55oC - 60oC và thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của Taqman probe khoảng 5oC - 10oC. Để thiết kế Taqman probe, nên thiết kế
để không dài quá 30 nu, tỷ lệ G-C trong probe khoảng 30-80 % với C nhiều hơn G, vị trí bắt cặp của đầu 5’ của Taqman probe chỉ 2-5 nu cách vị trí 3’ của mồi bắt cặp trên cùng sợi đích, và rất quan trọng là đầu 5’ gắn reporter không phải là G vì G có thể là quencher cho rất nhiều reporter. Khi thiết kế mồi cho real-time PCR dùng Taqman probe thì cũng nên lưu ý để chiều dài sản phẩm khếch đại trong khoảng 75- 150 nu, không nên quá 150 nu để hiệu quả PCR có thể đạt được tối hảo. Tuy nhiên trên thực tế cũng còn tùy thuộc vào trình tự gen đích có cho phép chúng ta chọn được mồi đạt được tối ưu để có sản phẩm khuếch đại đạt như vậy hay không.
b) Đánh giá trình tự mồi và probe thông qua phản ứng RT-qPCR
Khả năng bắt cặp đặc hiệu và khuếch đại gen đích của các trình tự mồi và probe sau khi thiết kế được đánh giá thông qua phản ứng realtime RT. Thành phần phản ứng RT-qPCR đánh giá khả năng khuếch đại của các cặp mồi và probe đặc hiệu HBV pgRNA được trình bày ở bảng sau:
Bảng 3: Thành phần phản ứng RT-qPCRSTT Thành phần Thể tích (µl) STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Đệm RT-PCR (2X) 10 2 Mồi xuôi (10µM) 0,5 3 Mồi ngược (10µM) 0,5 4 Probe (10µM) 0,2
5 Nước đã khử ion DNA/RNase free 3,78
6 Khuôn RNA 5
7 Enzyme RTase 0,02
Bảng 4: Chu trình nhiệt của phản ứng RT-qPCR
Steps T° T.gian đ.vị
Hold 50 10 phút
Biến tính 95 15 phút
Khuếch đại Biến tính 94 15 giây
N° chu kỳ: 45 Gắn mồi 60 30 giây
Kéo dài 72 30 giây
Lưu mẫu trên máy 25 ∞
2.2.5. Tối ưu quy trình RT-qPCR định lượng HBV RNA
a) Nghiên cứu thiết lập chứng dương RNA được tổng hợp in-vitro, chứng âm được tách chiết từ huyết tương người khỏe mạnh.
Chức năng cơ bản của cccDNA đó là khuôn cho quá trình phiên mã cho tất cả các RNA của virus bao gồm pregenomic RNA (pgRNA), từ đó tiếp tục tổng hợp tạo ra các DNA của virion [75]. Trong nghiên cứu này, RNA của HBV được tổng hợp in-vitro từ DNA tổng hợp nhân tạo có trình tự giống với pgRNA được chèn trong plasmid PJET1.2. Plasmid tái tổ hợp được cắt mở vòng bằng enzyme giới hạn
XhoI từ đó phiên mã RNA in-vitro tạo chứng dương và tạo bộ mẫu chuẩn HBV pgRNA.
Mẫu chứng âm được tách chiết từ huyết tương người khỏe mạnh sử dụng bộ kit QIAamp MinElute Virus Vacuum Kit.
b) Nghiên cứu thiết lập bộ mẫu chuẩn định lượng sử dụng RNA được tổng hợp in-vitro với dãy nồng độ xác định. Đánh giá độ ổn định của bộ mẫu chuẩn trước khi hoàn thiện.
Mẫu chứng dương pgRNA được tổng hợp qua quá trình phiên mã in-vitro
được tinh sạch sử dụng Liti Clorua, sau đó tiến hành đo nồng độ và đánh giá độ tinh sạch trên hệ thống máy Nanodrop, Thermo Scientific kiểm tra độ tinh sạch, tỉ lệ
260/280, 260/230 thỏa mãn các thông số yêu cầu đối với mẫu RNA. pgRNA in- vitro sau tinh sạch với nồng độ đã xác định được tính toán, quy đổi đơn vị từ ng/µL sang copy/µL để pha loãng tới các dải nồng độ khác nhau hơn kém nhau 10 lần tạo bộ mẫu chuẩn cho quy trình định lượng HBV pgRNA.
Công thức quy đổi:
Số bản copy = x 10-9 x 6,022 x 1023 (copy/µL)
c) Nghiên cứu thiết lập bộ mẫu chuẩn, panel độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng RT-qPCR đo tải lượng HBV pgRNA.
Để hình thành panel độ nhạy, nhóm nghiên cứu đã tiến hành xây dựng và đánh giá nồng độ mẫu chuẩn, sau đó pha loãng và chia nhỏ thành các nồng độ cách nhau 10 lần. Tiến hành đánh giá trên phản ứng RT-qPCR đã tối ưu. Với mỗi nồng độ mẫu chuẩn trong dải nồng độ trên được lặp lại mỗi nồng độ hai lần, với những nồng độ thấp thực hiện 3 lần lặp lại (với các nồng độ 102, 101, 100 copy/µL)
Các mẫu chuẩn với nồng độ xác định trong bộ panel được chia nhỏ vừa đủ cho hai đến ba lần sử dụng để đảm bảo chất lượng, tránh rã đông mẫu chuẩn quá nhiều lần có thể ảnh hưởng đến nồng độ cũng như ảnh hưởng đến chất lượng của đường chuẩn. Các mẫu chuẩn khi thực hiện mix phản ứng phải được bảo quản hoàn toàn trên đá, và phải được bảo quản đúng điều kiện quy định sau khi sử dụng xong.
Thiết lập panel độ đặc hiệu: Tiến hành tách chiết các mẫu thuộc nhóm chứng là những người tham gia khỏe mạnh. Sau đó tiến hành đánh giá các mẫu đã tách chiết trên quy trình RT-qPCR sử dụng cặp mồi và probe đặc hiệu với HBV pgRNA để đánh giá độ đặc hiệu của phản ứng. Đồng thời cũng đánh giá trên một số tác nhân khác gây bệnh gan không phải HBV như virus viêm gan C HCV.
d) Tối ưu điều kiện phản ứng bao gồm: nhiệt độ gắn mồi, thời gian các bước và tốc dộ thay đổi nhiệt độ của phản ứng của phản ứng RT-qPCR.
Tối ưu nhiệt độ bước phiên mã ngược:
Nhiệt độ bước phiên mã ngược sẽ phụ thuộc vào hai yếu tố: mồi ngược và enzyme có hoạt tính phiên mã ngược. Theo khuyến cáo của bộ kit cung cấp enzyme phiên mã ngược viết tắt là RTase, nhiệt độ thích hợp cho enzyme hoạt động là từ 45 - 50°C trong khoảng thời gian 10 phút. Vì vậy, nhóm nghiên cứu quyết định lựa chọn hai nhiệt độ là 45 và 50°C với thời gian là 10 phút để đánh giá ở nhiệt độ nào tối ưu cho phản ứng phiên mã ngược. Đồng thời nhiệt độ 45 - 50°C là nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ gắn mồi bình thường của một phản ứng Realtime PCR sẽ giúp mồi ngược bắt cặp với RNA dễ dàng hơn, tuy quá trình có thể gây ra sản phẩm phụ do có khả năng mồi tự bắt cặp.
Tối ưu quy trình realtime PCR sử dụng các mẫu chuẩn dương HBV pgRNA làm khuôn. Quy trình tối ưu nhiệt độ bước phiên mã ngược được thực hiện với thành phần phản ứng và chu trình như sau:
Bảng 5: Thành phần phản ứng RT-qPCRSTT Thành phần Thể tích (µl) STT Thành phần Thể tích (µl) 1 Đệm RT-PCR (2X) 10 2 Mồi xuôi (10µM) 0,5 3 Mồi ngược (10µM) 0,5 4 Probe (10µM) 0,2
5 Nước đã khử ion DNA/RNase free 3,78
6 Khuôn RNA 5
7 Enzyme RTase 0,02
Bảng 6: Chu trình nhiệt của phản ứng RT-qPCR với hai nhiệt độ khác nhau ở bước phiên mã ngược
Steps T° T.gian đ.vị
Hold 45 hoặc 50 10 phút
Biến tính 95 15 phút
Khuếch đại Biến tính 94 15 giây
N° chu kỳ: 45 Gắn mồi 63 30 giây
Kéo dài 72 30 giây
Lưu mẫu trên máy 25 ∞
Đặc biệt, trong quá trình thiết kế thí nghiệm có sử dụng một số mẫu không bổ sung enzyme RTase để đảm bảo không có sự nhiễm với DNA. Ngoài ra, ở bước “Kéo dài” trong chu trình “Khuếch đại” có cài đặt kênh thu nhận tín hiệu Green do sử dụng probe gắn huỳnh quang loại FAM trong quá trình mix thành phần phản ứng.
Tối ưu thời gian của bước phiên mã ngược
Sau khi lựa chọn được nhiệt độ gắn mồi tối ưu cho bước phiên mã ngược, tiếp tục tiến hành tối ưu thời gian phản ứng phiên mã ngược. Với thời gian ban đầu là 10 phút theo như gợi ý của hướng dẫn sử dụng, nhóm nghiên cứu đã quyết định lựa chọn hai mốc thời gian cùng với 10 phút là 20 phút và 40 phút.
Quá trình tối ưu thời gian phiên mã ngược sử dụng các mẫu chuẩn dương giống với bước tối ưu nhiệt độ của bước phiên mã ngược. Thực hiện quy trình định lượng với duy nhất yếu tố thời gian của bước phiên mã ngược thay đổi lên là 20 và 40 phút. Sau đó so sánh với kết quả thời gian 10 phút để tìm ra thời gian tối ưu cho bước phiên mã ngược.
Tối ưu nhiệt độ gắn mồi
Nhiệt độ gắn mồi là một yếu tố quan trọng trong phản ứng khuếch đại gen, không chỉ đối với riêng Realtime PCR hay như ở nghiên cứu này là RT-qPCR. Nhiệt độ gắn mồi phù hợp giúp mồi hoạt động hiệu quả hơn, đặc hiệu hơn, đặc biệt là trong các phản ứng Realtime có sử dụng chất phát tín hiệu huỳnh quang là TaqMan probe.
Nhiệt độ gắn mồi được nhóm nghiên cứu lựa chọn để tối ưu là nhiệt độ 57°C và 63°C, nhiệt độ gắn mồi thường sử dụng cho RT-qPCR dùng Taqman probe.
Tối ưu thời gian luân nhiệt
Chu trình luân nhiệt (bước Cycling) của một phản ứng Realtime PCR sử dụng TaqMan probe thường có ba giai đoạn nhiệt độ là: biến tính ở 94 - 95°C trong khoảng thời gian 15 - 30 giây, gắn mồi ở 60 - 63°C trong khoảng thời gian 30 giây và kéo dài ở 72°C trong khoảng thời gian từ 30 - 60 giây và đây là lúc máy realtime tiến hành đo tín hiệu huỳnh quang. Chu trình luân nhiệt này sẽ kéo dài khoảng 40 - 45 chu kỳ, dài hơn ở các quy trình PCR thường có số chu kỳ vào khoảng 30 - 35 chu kỳ, thậm chí ngắn hơn.
Các giai đoạn nhiệt độ cũng như thời gian ở chu trình này được trải dài khá rộng, tuy nhiên đối với phản ứng RT-qPCR cũng như các phản ứng thực hiện trên máy Realtime PCR thì quan trọng nhất là thời gian của bước gắn mồi, trong khoảng thời gian từ 15, 20 đến 30 giây.
Để tối ưu thời gian gắn mồi, nhóm nghiên cứu tiến hành khảo sát và so sánh kết quả với hai thời gian gắn mồi là 15 và 30 giây để có thể tiến hành trên hai máy để giảm bớt những sai số có thể xảy ra gây sự khác biệt trong kết quả cũng như không lựa chọn được điều kiện tối ưu.
e) Tối ưu các thành phần phản ứng RT-PCR, gồm có buffer, các enzyme DNA polymerase, nồng độ primer và probe. Thành phần phản ứng bao gồm cả dUTP và AmpErase uracil N-glycosylase để chống ngoại nhiễm.
Khác với phản ứng PCR, vì realtime PCR, đặc biệt là các phản ứng realtime PCR có TaqMan probe là các phản ứng có liên quan đến chất phát và tín hiệu huỳnh quang. Do vậy, các buffer sử dụng trong quá trình Realtime PCR đa phần không cần bổ sung những thành phần như Taq polymerase có hoạt tính 5’-3’ exonuclease, dNTP hay MgCl2 mà thường hầu như đã có đầy đủ sẵn trong Buffer Realtime PCR. Ngoài ra các buffer này còn cho rõ là buffer loại bao nhiêu X để có thể tùy theo từng ứng dụng có thể tích cuối khác nhau để lựa chọn sử dụng buffer cho hợp lý, ở đây nồng độ Buffer được sử dụng là Quantitect Master mix 2X. Vì vậy với phản ứng Realtime PCR thường chỉ có các thành phần là: Buffer, Mồi, Probe và Nước đã khử ion DNA/RNase free. Ngoài ra có thể thêm một số hóa chất phụ gia như dUTP, UNG để ngăn cản quá trình ngoại nhiễm xảy ra gây ảnh hưởng đến phản ứng.
Tối ưu nồng độ mồi
Khi tối ưu các thành phần của quá trình RT-qPCR, nhóm nghiên cứu đã tiến hành khảo sát trên một số các thành phần chính như: nồng độ mồi, nồng độ probe cũng như các chất phụ gia khác nếu có.
Đầu tiên nhóm nghiên cứu tiến hành tối ưu nồng độ mồi. Với nồng độ mồi của phản ứng Realtime PCR thường khảo sát trên một dải nồng độ mồi từ 0,05 đến 1 µM, sau đó dựa vào Ct value và hiệu suất khuếch đại sẽ chọn ra nồng độ mồi thích hợp cho phản ứng và tiếp tục tối ưu với các thành phần phản ứng khác.
Tối ưu nồng độ probe
Tiếp theo, nhóm nghiên cứu tiếp tục tối ưu thành phần phản ứng vô cùng quan trọng trong phản ứng định lượng RT-qPCR, đó là nồng độ probe. Nồng độ probe sẽ được thực hiện tối ưu dựa theo nồng độ mồi đã tối ưu ở trên là 0,5 µM. Hai nồng độ probe được nhóm nghiên cứu lựa chọn để đánh giá đó là nồng độ 0,1 và 0,2 µM.
Các chất phụ gia trong phản ứng RT-qPCR
Ưu điểm của phản ứng RT-qPCR Onestep là quá trình tạo cDNA ở trong cùng một ống phản ứng với quá trình khuếch đại cho nên tránh việc mở nắp ống để mix phản ứng bước hai và giảm nguy cơ gây nhiễm, đồng thời đơn giản các bước thực hiện quy trình.
Một trong số các nguồn dễ gây nhiễm nhất cho PCR là sản phẩm PCR của chính những lần khuếch đại trước nên có thể sử dụng enzyme AmpErase uracil N- glycolase (UNG) để phá hủy các sản phẩm này bằng cơ chế enzyme và hóa học nhưng không phá hủy ADN tự nhiên (khuôn mẫu hay đoạn mồi). Hơn nữa, Taq ADN polymerase nhận dUTP là cơ chất, do vậy có thể sử dụng UNG để tránh nhiễm. UNG xúc tác quá trình loại bỏ uracil khỏi ADN sợi đơn hoặc kép được tổng hợp từ dUTP – một trong 3 loại nucleotide của PCR. Dưới tác dụng của UNG, các vị trí kiềm được hình thành và trong điều kiện nhiệt độ cao, pH kiềm, các vị trí kiềm này sẽ bị phân cắt.
Tuy nhiên, đặc tính của UNG là cắt đứt liên kết giữa RNA và cDNA (theo hướng dẫn sử dụng trên trang web của hóa chất này), và thực tế việc đánh giá cũng đã cho thấy kết quả tương tự. Các mẫu có bổ sung UNG đều cho kết quả âm tính khi trong khi không bổ sung UNG cho kết quả dương tính, kể cả mẫu chứng dương.
2.2.6. Đánh giá quy trình RT-qPCR định lượng HBV RNA
Ngưỡng phát hiện, ngưỡng định lượng:
Sau khi đã tối ưu thành phần phản ứng (buffer, nồng độ mồi, nồng độ probe) và chu trình phản ứng (nhiệt độ phiên mã ngược, nhiệt độ gắn mồi), tiếp tục tiến hành đánh giá quy trình trên dải nồng độ từ 1,25 – 2,5 - 5 - 101 đến 104 copy/pư để xác định ngưỡng phát hiện và ngưỡng định lượng của quy trình định lượng tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB. Với mỗi nồng độ mẫu chuẩn trong dải nồng độ trên được lặp lại mỗi nồng độ hai lần, với những nồng độ thấp nên cân nhắc thực hiện 3 lần lặp lại.
Ngưỡng phát hiện được xác định là nồng độ thấp nhất mà tại đó trên 95% tổng số lần chạy cho tín hiệu. Ngưỡng định lượng được xác định là nồng độ thấp