bệnh nhân CHB.
3.1.1. Nghiên cứu thiết lập chứng dương RNA được tổng hợp in-vitro, chứng âm được tách chiết từ huyết tương người khỏe mạnh.
Chứng dương RNA là trình tự pgRNA phiên mã từ khuôn là trình tự DNA sợi âm trên ngân hàng gen GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/) với mã số hiệu là MF674459.1, genotype B, subtype B4 là trình tự đại diện phổ biến nhất ở Việt Nam. Trình tự toàn bộ hệ gen HBV DNA đã được công bố trên ngân hàng gen GenBank.
Trình tự DNA được tổng hợp nhân tạo và được đưa vào trong plasmid pJET1.2. Plasmid tái tổ hợp chứa trình tự DNA đích được mở vòng bằng enzyme cắt giới hạn XhoI và làm khuôn cho quá trình tổng hợp RNA in-vitro, để tạo chứng dương pgRNA của HBV cho quy trình RT-qPCR.
Sau khi tổng hợp RNA in-vitro, pgRNA chứng dương tinh sạch có nồng độ 15,59 ng/µL, các chỉ số 260/280: 1,67; 260/230: 1,85. Như vậy chứng dương có nồng độ cao và độ tinh sạch tốt được sử dụng làm mẫu chuẩn dương cho quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA, đồng thời RNA in-vitro được pha loãng tới các dải nồng độ để tạo bộ mẫu chuẩn HBV pgRNA phục vụ cho việc xây dựng đường chuẩn và panel độ nhạy.
Mẫu chứng âm được tách chiết thành công từ huyết tương người khỏe mạnh có nồng độ 7,6 ng/µL, độ tinh sạch đảm bảo.
3.1.2. Nghiên cứu thiết lập bộ mẫu chuẩn định lượng sử dụng RNA được tổng hợp in-vitro với dãy nồng độ xác định. Đánh giá độ ổn định của bộ mẫu chuẩn trước khi hoàn thiện.
Tính toán số bản copy của mẫu chuẩn:
+ Số bản copy =
x 10-9 x 6,022 x 1023 =2,69 x 1010 (copy/µl)
Vì sử dụng 6 µL cho một phản ứng nên số bản sao trong 1 phản ứng là: 1,61 x 1011 (copy/phản ứng)
Sau khi tính toán xong ghi lại nồng độ và ghi trên chính ống stock để thuận tiện trong việc pha loãng sau này cũng như thu thập số liệu cho nghiên cứu.
Từ nồng độ gốc, mẫu chuẩn được pha loãng tới các dải nồng độ xác định cách nhau 10 lần tạo bộ mẫu chuẩn. Kết quả thu được bộ mẫu chuẩn bao gồm các mẫu chuẩn có nồng độ như sau: 1,61 x 1011(nồng độ stock), 1010, 109, 108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101, 100 (copy/pư). Ký hiệu: S10, S9, S8, S7, S6, S5, S4, S3, S2, S1, S0.
3.1.3. Thiết kế trình tự mồi và probe cho phản ứng RT-qPCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB. pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB.
Căn cứ vào độ ổn định và tính đa hình, đột biến, vùng gen được lựa chọn thiết kế mồi và probe cho quy trình định lượng HBV pgRNA là vùng gen S.
Kết quả lựa chọn cặp mồi/probe:
Sử dụng công cụ thiết kế mồi và các thông tin liên quan đến đoạn gen của HBV pgRNA, nhóm nghiên cứu đã thiết kế một số cặp mồi/TaqMan probe có khả năng khuếch đại đặc hiệu trình tự gen đích quan tâm. Ba cặp mồi/probe được kí hiệu lần lượt là: 482/198/361, 482/585/361, và 482/223/361. Thông qua phản ứng RT-qPCR và đánh giá trên mẫu chuẩn dương HBV pgRNA S4 và S5, nhóm nghiên cứu tiến hành đánh giá nhằm lựa chọn ra cặp mồi/probe có khả năng khuếch đại tốt nhất trình tự quan tâm.
Hình 6: Kết quả phản ứng RT-qPCR đánh giá mồi/probe.
Chú thích hình: Các cặp mồi được kí hiệu số hiệu lần lượt là 198+, 223+, 585+. Hai mẫu chuẩn S5, S4 được lựa chọn để đánh giá với kí hiệu tương ứng là 12 và 34. Các mẫu có chữ “AM”
là chứng âm của phản ứng
Sử dụng 2 mẫu chuẩn với nồng độ trung bình được lựa chọn trong bộ mẫu chuẩn: S4 (104), S5 (105). Mỗi mẫu chuẩn được chia thành các ống nhỏ; 2 ống mẫu chuẩn tương ứng của S5, S4 ký hiệu là 12 và 34 được sử dụng cho quá trình tối ưu.
Như kết quả Hình 5, các cặp mồi và probe được thiết kế đều có khả năng khuếch đại trình tự đích quan tâm (HBV pgRNA), ngoài ra các cặp mồi và probe đều cho thấy tính đặc hiệu cao khi các chứng âm đều không cho thấy tín hiệu khuếch đại. Tuy nhiên những cặp mồi và probe này có điểm khác biệt rất lớn, đó chính là hiệu suất khuếch đại khác nhau. Theo như kết quả của phản ứng, cặp mồi có ký hiệu 482/223/361 (là cặp mồi và probe có trình tự đã được trình bày ở trên) cho thấy tiềm năng là có tín hiệu khuếch đại tốt nhất trong cả ba cặp mồi và probe. Tín hiệu huỳnh quang cũng như Ct được thể hiện trên bảng kết quả đều chỉ ra cặp mồi và probe với kí hiệu 223 chính là cặp mồi và probe được lựa chọn cho quy trình định lượng tải lượng HBV pgRNA bằng phương pháp RT-qPCR.
đều chỉ ra rằng cặp mồi và probe kí hiệu 482/223/361 có tín hiệu khuếch đại tốt nhất, và nhóm nghiên cứu quyết định lựa chọn cặp mồi và probe này cho những quy trình tối ưu tiếp theo.
Sau quá trình thử nghiệm và đánh giá bước đầu để tìm ra cặp mồi/probe có khả năng khuếch đại hiệu quả và đặc hiệu HBV pgRNA, nhóm nghiên cứu đã xác định cặp mồi/probe tối ưu cho quy trình RT-qPCR.
Trình tự mồi phiên mã ngược đặc hiệu của HBV là: 5’ - GACAAACGGGCAACATACCT - 3’ ([nt] 476 – 457).
Trình tự forward primer là: 5’ - ATGTGTCTGCGGCGTTTTAT - 3’ ([nt] 377 – 396).
Trình tự probe là : 5’ - FAM – ATCCTGCTGCTATGCCTCAT - BHQ1 - 3’ ([nt] 410 – 429).
Hình 7: Bản đồ trình tự mồi/probe cho quy trình RT-qPCR
3.1.4. Nghiên cứu thiết lập bộ panel độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng RT-qPCR đo tải lượng HBV pgRNA. qPCR đo tải lượng HBV pgRNA.
Mẫu chuẩn RNA được pha loãng xuống các dải nồng độ xác định để tạo panel độ nhạy.
Pha loãng từ nồng độ 1011 xuống đến nồng độ 100: Pha loãng xuống 1010: 10µL 1011
+ 90µL H2O Pha loãng xuống 109: 10µL 1010 + 90µL H2O Pha loãng xuống 108: 10µL 109
+ 90µL H2O Pha loãng xuống 107: 10µL 108 + 90µL H2O Pha loãng xuống 106: 10µL 107 + 90µL H2O Pha loãng xuống 105: 10µL 106
+ 90µL H2O Pha loãng xuống 104: 10µL 105 + 90µL H2O Pha loãng xuống 103: 10µL 104 + 90µL H2O Pha loãng xuống 102: 10µL 103
+ 90µL H2O Pha loãng xuống 101: 10µL 102 + 90µL H2O Pha loãng xuống 100: 10µL 101 + 90µL H2O
Hình 8: Panel độ nhạy
Kết quả thiết lập bộ panel độ nhạy chạy đánh giá bằng phản ứng RT-qPCR trên hệ thống Rotor GenQ:
Hình 9: Kết quả thiết lập bộ panel độ nhạy.
Hình 10: Kết quả dựng đường chuẩn từ panel độ nhạy.
Trong quá trình thiết lập đường chuẩn có một giá trị thông số là hệ số tương quan R2 cho thấy độ tuyến tính của quá trình khuếch đại. Thông số R2 đạt tiêu chuẩn lớn hơn 0,99, cho thấy quy trình realtime PCR có độ tuyến tính tốt. Bên cạnh đó, hiệu quả PCR hay E% (PCR efficiency) của quy trình đạt được là 0,97, cho thấy khả năng khuếch đại tốt của cặp mồi cũng như các mẫu chuẩn thiết kế.
Để thiết lập bộ panel độ đặc hiệu, nghiên cứu sử dụng 50 mẫu chứng khỏe mạnh của người tham gia nghiên cứu, trong đó tiền sử chưa từng mắc các bệnh liên quan đến HBV hay những vấn đề về gan khác, cũng không có tiền sử sử dụng rượu bia hay các chất kích thích khác.
Bên cạnh đó có kiểm tra đánh giá định lượng trên các mẫu virus HCV là một virus viêm gan C. Kết quả đánh giá trên bộ panel độ đặc hiệu cho thấy độ đặc hiệu của phản ứng là 100%.
Hình 11: Kết quả bộ panel độ đặc hiệu
HBV+: mẫu chứng dương HBV, NTC: mẫu chứng âm, HCV+: mẫu đối chứng HCV, 88, 75, 85, 54, 62, 43, 38, 66, 48, 57, 44, 12: mẫu chứng âm người khỏe mạnh, IC+: chứng dương nội chuẩn,
IC 88, IC75, IC 54: chứng nội chuẩn trong các mẫu 88, 75, 54, IC-: chứng âm nội chuẩn.
3.2. Tối ưu quy trình realtime RT- PCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB. tương bệnh nhân CHB.
3.2.1. Tối ưu điều kiện phản ứng bao gồm: nhiệt độ gắn mồi, thời gian các bước và tốc dộ thay đổi nhiệt độ của phản ứng của phản ứng RT-qPCR. và tốc dộ thay đổi nhiệt độ của phản ứng của phản ứng RT-qPCR.
Tối ưu nhiệt độ gắn mồi bước phiên mã ngược:
Kết quả của quy trình phiên mã ngược được thực hiện ở 45℃ trong vòng 10 phút sẽ được trình bày dưới đây:
Hình 12: Kết quả của phản ứng RT-qPCR trên phần mềm RotorGene với nhiệt độ 45℃.
45.1 và 45.2: hai mẫu chuẩn dương S4 và S5 được phiên mã ngược ở nhiệt độ 45°C trong khoảng thời gian 10 phút. 45 E- là mẫu không bổ sung enzyme RTase và 45 NTC là mẫu chứng âm
của phản ứng này
Kết quả của quy trình phiên mã ngược được thực hiện ở nhiệt độ 50°C trong vòng 10 phút sẽ được trình bày dưới đây:
Hình 13: Kết quả của phản ứng RT-qPCR trên phần mềm RotorGene với nhiệt độ 50°C.
50.1 và 50.2 là hai mẫu chuẩn dương S4 và S5 với thứ tự các mẫu giống như mẫu 45.1 và 45.2 và được phiên mã ngược ở nhiệt độ 50°C trong khoảng thời gian 10 phút. 50 E- là mẫu không
bổ sung enzyme RTase và 50 NTC là mẫu chứng âm của phản ứng này.
Như vậy, theo như kết quả so sánh với hai nhiệt độ ở bước phiên mã ngược khác nhau, nhóm nghiên cứu nhận thấy Ct value ở nhiệt độ bước phiên mã ngược 50°C sớm hơn giá trị Ct ở nhiệt độ 45°C khoảng 1-2 chu kỳ. Hơn nữa, nếu nhìn vào chu kỳ khuếch đại, tín hiệu khuếch đại ở nhiệt độ 50°C cho thấy hiệu suất khuếch đại tốt hơn, đường tín hiệu cao hơn ở nhiệt độ 45°C. Không chỉ ở hai mẫu này mà khảo sát trên một số mẫu bệnh nhân CHB cũng cho thấy kết quả như vậy. Bên cạnh đó, mẫu chứng âm enzyme không cho thấy phản ứng không có lẫn HBV DNA, và như vậy quá trình tách chiết và xử lý sau tách chiết đã loại hết HBV DNA, điều đó giúp quá trình định lượng không bị ảnh hưởng. Mẫu chứng âm nước cũng không có tín hiệu khuếch đại, chứng tỏ phản ứng có độ đặc hiệu tốt.
Như vậy, nhiệt độ tối ưu cho bước phiên mã ngược RNA của quy trình định lượng là nhiệt độ 50°C.
Tối ưu thời gian bước phiên mã ngược
Kết quả của quy trình phiên mã ngược được thực hiện ở nhiệt độ 50°C trong vòng 10 phút thể hiện qua hình 13:
Kết quả của quy trình phiên mã ngược được thực hiện ở nhiệt độ 50°C trong vòng 20 phút như sau:
Hình 14: Thời gian phiên mã ngược 20 phút.
T20 M2 và T20M1 là hai mẫu chuẩn dương S4 và S5 được phiên mã ngược ở nhiệt độ 50°C trong khoảng thời gian 20 phút. T20 E- là mẫu không bổ sung enzyme RTase và T20 NTC là mẫu chứng
âm của phản ứng này.
Kết quả của quy trình phiên mã ngược được thực hiện ở nhiệt độ 50°C trong vòng 40 phút như sau:
Hình 15: Thời gian phiên mã ngược 40 phút.
T40 M1 và T40 M2 là hai mẫu chuẩn dương S5 và S4 được phiên mã ngược ở nhiệt độ 50°C trong khoảng thời gian 40 phút. T20 E- là mẫu không bổ sung enzyme RTase và T20 NTC là mẫu chứng
âm của phản ứng này.
Với ba hình kết quả hình 13, hình 14, hình 15 tương ứng với từng thời gian phiên mã ngược lần lượt là 10; 20 và 40 phút, nhóm nghiên cứu nhận thấy Ct ở hai mẫu M1 và M2 đều giảm dần khi tăng thời gian phiên mã ngược. Vì vậy, 10 phút chính là khoảng thời gian vừa đủ để phản ứng phiên mã ngược diễn ra, việc tăng thời gian là không cần thiết và có khả năng làm giảm độ nhạy của phản ứng.
Tối ưu nhiệt độ gắn mồi qPCR
Hình 16: Nhiệt độ gắn mồi 63°C.
T1, T2, T6: là các mẫu chuẩn dương RNA S4
Hình 17: Nhiệt độ gắn mồi 57°C.
T1, T2, T6: là các mẫu chuẩn dương RNA S4, AM: mẫu chứng âm
Sau khi khảo sát trên mẫu chuẩn dương S4 nhóm nghiên cứu nhận thấy nhiệt độ gắn mồi 63°C là nhiệt độ tối ưu cho quá trình RT-qPCR. Các giá trị Ct của các tube S5 ở nhiệt độ 63°C đều sớm hơn nhiệt độ 57°C từ 1 - 2 chu kì. Hơn hết, nhiệt độ gắn mồi cao hơn giúp phản ứng PCR đặc hiệu hơn.
Tối ưu thời gian gắn mồi:
Sau đây là kết quả của quá trình tối ưu thời gian gắn mồi trong chu trình luân nhiệt:
Hình 18: Kết quả ở thời gian gắn mồi 15 giây.
T15: Mẫu chuẩn dương S4 với thời gian gắn mồi 15 giây, NTC: mẫu chứng âm
Hình 19: Kết quả ở thời gian gắn mồi 30 giây.
T30: Mẫu chuẩn dương S4 với thời gian gắn mồi 30 giây, NTC: mẫu chứng âm Theo như kết quả so sánh giữa hai thời gian gắn mồi thì với cùng một mẫu, ở thời gian kéo dài là 30 giây cho giá trị Ct sớm hơn 2 chu kỳ, tức là lượng sản phẩm gấp 4 lần, so với thời gian kéo dài 15 giây (29,16 so với 31,71). Như vậy, thời gian
3.2.2. Tối ưu các thành phần phản ứng RT-PCR, gồm có buffer, các enzyme DNA polymerase, nồng độ mồi và probe. Thành phần phản ứng bao gồm cả DNA polymerase, nồng độ mồi và probe. Thành phần phản ứng bao gồm cả dUTP và AmpErase uracil N-glycosylase để chống ngoại nhiễm.
Tối ưu nồng độ primer:
Kết quả tối ưu nồng độ mồi được trình bày ở hình sau:
Hình 20: Kết quả tối ưu nồng độ mồi.
RNA HBV+: mẫu chứng dương HBV RNA, 1E+: mẫu chứng dương nồng độ mồi 1 µM, 0,5E+, 0,2 E+; 0,1 E+1; 0,1E+2; 0,05E+1; 0,05E+2 lần lượt là các mẫu chứng dương ở các dải nồng độ mồi 0,5; 0,2;0,1; 0,05;-0: mẫu chứng âm; 0,05-: mẫu chứng âm không enzyme nồng độ mồi 0,05.
Như vậy, theo như kết quả RT-qPCR và so sánh dựa trên giá trị Ct, nồng độ mồi 1 và 0,5 µM đều cho giá trị Ct khoảng chu kỳ thứ 29, tuy nhiên nhóm nghiên cứu quyết định lựa chọn nồng độ mồi là 0,5 µM vì sử 1 µM là nồng độ mồi khá cao và có thể ảnh hưởng đến quá trình probe gắn vào trình tự đích do cạnh tranh với mồi trong thành phần phản ứng. Nhất là có nhiệt độ ủ khoảng 50°C ở thời gian đầu càng tạo điều kiện cho mồi gắn vào trước probe.
Theo như kết quả Realtime ở hình 19 và hình 20, nồng độ probe tạo nên sự khác biệt rất lớn trong quy trình định lượng trên cùng một chứng dương. Và do Ct value lên sớm hơn khoảng 3 chu kỳ, nồng độ probe 0,2 µM đã được lựa chọn là nồng độ tối ưu cho quy trình định lượng HBV pgRNA.
Hình 21: Kết quả đánh giá ở nồng độ probe 0,2 µM
P 0,1: Mẫu chứng dương nồng độ probe 0,1, NTC: mẫu chứng âm
P 0,1: Mẫu chứng dương nồng độ probe 0,1; NTC: mẫu chứng âm
3.2.3. Quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA
Sau quá trình tối ưu các thành phần của phản ứng RT-qPCR, nhóm nghiên cứu đã xây dựng thành công bảng thành phần tối ưu của phản ứng RT-qPCR.
Bảng 7: Thành phần tối ưu của một phản ứng RT-qPCR
STT Thành phần Thể tích (µl)
1 Đệm RT-PCR (2X) 10
2 Mồi xuôi (10µM) 1
3 Mồi ngược (10µM) 1
4 Probe (10µM) 0,4
5 Nước đã khử ion DNA/RNase free 1,58
6 Enzyme RTase 0,02
7 RNA template 6
Tổng 20
Sau khi thực hiện quá trình tối ưu các điều kiện trong chu trình nhiệt của phản ứng RT-qPCR ở rất nhiều các khía cạnh như: thời gian cũng như nhiệt độ, nhóm nghiên cứu xin đưa ra bảng tổng kết chu trình nhiệt tối ưu cho phản ứng định