3.1. Thiết kế phản ứng RT-qPCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương
3.1.4. Nghiên cứu thiết lập bộ panel độ nhạy và độ đặc hiệu của phản ứng RT-
qPCR đo tải lượng HBV pgRNA.
Mẫu chuẩn RNA được pha loãng xuống các dải nồng độ xác định để tạo panel độ nhạy.
Pha loãng từ nồng độ 1011 xuống đến nồng độ 100: Pha loãng xuống 1010: 10µL 1011
+ 90µL H2O Pha loãng xuống 109: 10µL 1010 + 90µL H2O Pha loãng xuống 108: 10µL 109
+ 90µL H2O Pha loãng xuống 107: 10µL 108 + 90µL H2O Pha loãng xuống 106: 10µL 107 + 90µL H2O Pha loãng xuống 105: 10µL 106
+ 90µL H2O Pha loãng xuống 104: 10µL 105 + 90µL H2O Pha loãng xuống 103: 10µL 104 + 90µL H2O Pha loãng xuống 102: 10µL 103
+ 90µL H2O Pha loãng xuống 101: 10µL 102 + 90µL H2O Pha loãng xuống 100: 10µL 101 + 90µL H2O
Hình 8: Panel độ nhạy
Kết quả thiết lập bộ panel độ nhạy chạy đánh giá bằng phản ứng RT-qPCR trên hệ thống Rotor GenQ:
Hình 9: Kết quả thiết lập bộ panel độ nhạy.
Hình 10: Kết quả dựng đường chuẩn từ panel độ nhạy.
Trong quá trình thiết lập đường chuẩn có một giá trị thông số là hệ số tương quan R2 cho thấy độ tuyến tính của quá trình khuếch đại. Thông số R2 đạt tiêu chuẩn lớn hơn 0,99, cho thấy quy trình realtime PCR có độ tuyến tính tốt. Bên cạnh đó, hiệu quả PCR hay E% (PCR efficiency) của quy trình đạt được là 0,97, cho thấy khả năng khuếch đại tốt của cặp mồi cũng như các mẫu chuẩn thiết kế.
Để thiết lập bộ panel độ đặc hiệu, nghiên cứu sử dụng 50 mẫu chứng khỏe mạnh của người tham gia nghiên cứu, trong đó tiền sử chưa từng mắc các bệnh liên quan đến HBV hay những vấn đề về gan khác, cũng không có tiền sử sử dụng rượu bia hay các chất kích thích khác.
Bên cạnh đó có kiểm tra đánh giá định lượng trên các mẫu virus HCV là một virus viêm gan C. Kết quả đánh giá trên bộ panel độ đặc hiệu cho thấy độ đặc hiệu của phản ứng là 100%.
Hình 11: Kết quả bộ panel độ đặc hiệu
HBV+: mẫu chứng dương HBV, NTC: mẫu chứng âm, HCV+: mẫu đối chứng HCV, 88, 75, 85, 54, 62, 43, 38, 66, 48, 57, 44, 12: mẫu chứng âm người khỏe mạnh, IC+: chứng dương nội chuẩn,
IC 88, IC75, IC 54: chứng nội chuẩn trong các mẫu 88, 75, 54, IC-: chứng âm nội chuẩn.