3.3. Đánh giá chất lượng quy trình RT-qPCR
3.3.1. Xác định ngưỡng phát hiện, ngưỡng định lượng trong mỗi lần xét
Xác định độ chính xác, độ lặp lại giữa các lần xét nghiệm của quy trình RT-PCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB.
Ngưỡng phát hiện, ngưỡng định lượng:
Nhóm nghiên cứu thực hiện đánh giá quy trình RT-qPCR đã được tối ưu dựa vào bộ mẫu chuẩn đã được thiết lập. Trong một lần chạy, các mẫu nồng độ được lặp lại ba lần. Tất cả nồng độ đều được thực hiện đánh giá trong 10 lần chạy và ghi chép lại kết quả, tổng hợp số lần chạy cho tín hiệu khuếch đại có ý nghĩa chia tỉ lệ với tổng số phản ứng để xác định ngưỡng định lượng và ngưỡng phát hiện của quy trình định lượng HBV pgRNA.
Bảng 9: Kết quả đánh giá quy trình định lượng trên dải nồng độ 104 – 1,25 copy/phản ứng trong 10 lần chạy
Nồng độ (copy/phản ứng) Số lần phát hiện/Tổng số phản ứng Tỉ lệ 104 30/30 100 % 103 30/30 100 % 102 30/30 100 % 101 30/30 100 % 5 29/30 97 % 2,5 11/30 37 % 1,25 0/30 0 %
Dựa trên kết quả quá trình đánh giá các mẫu nồng độ thấp 102, 101, và các mẫu pha loãng 2 lần, 4 lần, 8 lần của nồng độ 101 trên phản ứng (Bảng 9), nhóm nghiên cứu nhận thấy ngưỡng định lượng của phản ứng là 101 copy/phản ứng (30/30 lần chạy lặp lại đều cho tín hiệu, tương ứng với tỉ lệ 100%), và mẫu pha loãng 2 lần của mẫu 101 copy/ phản ứng (tức là 5 copy/phản ứng) là ngưỡng phát hiện (29/30 lần lặp lại đều cho tín hiệu, đạt tỉ lệ 97%). Khả năng khuếch đại tốt của cặp mồi cũng như các mẫu chuẩn thiết kế đều đạt chất lượng ổn định trong các lần chạy khác nhau. Độ đặc hiệu được thể hiện qua chứng không có mẫu chuẩn (chứng âm) đạt tỉ lệ 100%, chứng tỏ độ đặc hiệu của quy trình tốt, có tính ổn định cao.
Khi nhân với hệ số cô đặc của quá trình tách chiết là 10, thì ngưỡng phát hiện của phản ứng RT-qPCR là 80 copy/mL huyết tương, ngưỡng định lượng là 160 copy/mL huyết tương.
Đô chính xác, độ lặp lại của quy trình:
Để xác định các thông số về chất lượng của phản ứng Realtime PCR được nhóm thiết lập, các sản phẩm gồm chứng dương, chứng âm và bộ mẫu chuẩn với dải nồng độ xác định được thiết lập với mẫu chuẩn là chứng dương pgRNA HBV được tạo ra qua quá trình tổng hợp RNA in-vitro dựa trên trình tự HBV DNA ở Việt Nam. Kết quả chạy đánh giá quy trình RT-PCR được trình bày ở hình sau:
Hình 23: Kết quả chạy đánh giá quy trình dựa trên bộ mẫu chuẩn
108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101, 100: dãy nồng độ mẫu chuẩn, NTC: chứng âm.
Bảng 10: Kết quả chạy đánh giá quy trình dựa trên bộ mẫu chuẩnTên Tên mẫu Loại Ct Nồng độ (copy/ml) S8 Mẫu chuẩn 13,92 1,600,000,000 S8 Mẫu chuẩn 14,22 1,600,000,000 S7 Mẫu chuẩn 17,94 160,000,000 S7 Mẫu chuẩn 17,82 160,000,000 S6 Mẫu chuẩn 21,47 16,000,000
S6 Mẫu chuẩn 21,47 16,000,000 S5 Mẫu chuẩn 24,41 1,600,000 S5 Mẫu chuẩn 24,41 1,600,000 S4 Mẫu chuẩn 28,68 160,000 S4 Mẫu chuẩn 30,55 160,000 S3 Mẫu chuẩn 32,82 16,000 S3 Mẫu chuẩn 32,39 16,000 S3 Mẫu chuẩn 32,01 16,000 S2 Mẫu chuẩn 36,09 1,600 S2 Mẫu chuẩn 35,24 1,600 S2 Mẫu chuẩn 35,33 1,600 S1 Mẫu chuẩn 39,31 160 S1 Mẫu chuẩn 37,36 160 S1 Mẫu chuẩn 38,27 160
Bảng 11: Xử lý thống kê thông qua các chỉ số SD, CV, độ lệch phép đo (ME)
Mẫu chuẩn
Chu kỳ
phát hiện (Ct)
Tải lượng RNA-HBV (Log10 copie/ml)
Ghi chú
CV SD CV SD %ME
107 copy/phản ứng 0,01 0,08 0,01 0,15 0,63 106 copy/phản ứng 0,01 0,00 0,03 0,02 1,22 105 copy/phản ứng 0,01 0,00 0,02 0,01 2,01 104 copy/phản ứng 0,01 1,32 0,02 0,16 0,75 103 copy/phản ứng 0,01 0,41 0,01 0,28 0,43 102 copy/phản ứng 0,01 0,46 0,01 0,19 1,51 101 copy/phản ứng 0,01 0,97 0,03 0,87 2,33
Kết quả trên hình 23 và bảng 10, 11 cho thấy quy trình RT-qPCR định lượng HBV pgRNA có độ chính xác cao (CV<= 0,03), độ lặp lại tốt (deltaCt<0,5). Quy trình tiếp tục được đánh giá trên mẫu bệnh nhân CHB trước khi được đưa vào sử dụng.
3.3.2. Xác định tính ổn định của bộ mẫu chuẩn trên quy trình RT-PCR đo tải lượng HBV pgRNA trong huyết tương bệnh nhân CHB.
Kết quả đánh giá bộ mẫu chuẩn trên quy trình định lượng RT-qPCR dựa trên bộ mẫu chuẩn sau 2 tuần, 1 tháng, 2 tháng và 3 tháng được trình bày theo kết quả hình ảnh RT-qPCR.
108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101, 100 (copy/pư): dãy nồng độ mẫu chuẩn, NTC: chứng âm.
Hình 25: Kết quả đánh giá bộ mẫu chuẩn sau một tháng.
108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101, 100(copy/pư): dãy nồng độ mẫu chuẩn, NTC: chứng âm.
Hình 26: Kết quả đánh giá bộ mẫu chuẩn sau hai tháng.
Hình 27: Kết quả đánh giá bộ mẫu chuẩn sau ba tháng.
108, 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101, 100 (copy/pư): dãy nồng độ mẫu chuẩn, NTC: chứng âm.
Bảng 12: Kết quả đánh giá độ ổn định của quy trình RT-PCR
Hai tuần Một tháng Hai tháng Ba tháng
Mẫu 1 (Ct) 13,58 14,10 14,41 14,22 Mẫu 2 (Ct) 17,11 17,37 18,08 17,82 Mẫu 3 (Ct) 20,24 20,22 21,45 21,47 Mẫu 4 (Ct) 23,69 23,75 24,51 24,41 Mẫu 5 (Ct) 26,75 26,85 28,72 28,68 Mẫu 6 (Ct) 30,46 30,34 32,03 32,10 Mẫu 7 (Ct) 33,57 33,68 35,26 35,33 Mẫu 8 (Ct) 37,81 37,72 38,20 38,37
Từ những kết quả đánh giá quy trình định lượng RT-PCR dựa trên bộ mẫu chuẩn sau hai tuần, một tháng, hai tháng, ba tháng, nhóm nghiên cứu nhận thấy bộ mẫu chuẩn ổn định, vẫn có khả năng khuếch đại các mẫu trong dải tuyến tính từ 108 - 101 copy/pư với sự khác biệt không lớn về giá trị Ct value. Các mẫu nồng độ thấp
vẫn không có sự thay đổi nhiều và các mẫu vẫn cho thấy có độ tuyến tính tốt. Các thông số của lần chạy tốt, bộ mẫu chuẩn ổn định trong các khoảng thời gian đánh giá.
Tiếp tục đánh giá bộ mẫu chuẩn trong thời gian tới nhằm đảm bảo chất lượng của quy trình định lượng, đặc biệt là khi có bất kì sự thay đổi nào trong quy trình định lượng như thay đổi vị trí đặt máy Realtime PCR, cập nhật chương trình hay phần mềm của máy tính phân tích kết quả, hay thay đổi hóa chất sinh phẩm mới, lô sinh phẩm mới trong quy trình phân tích mẫu.