D. Tách chiết và tinh sạch DNA từ mẫu bệnh nhầy họng theo phƣơng pháp « BOOM »
B. Tối ƣu nồng độ mồ
Phản ứng mPCR 1 và mPCR 2 đều có 4 cặp mồi. Ban đầu chúng tôi tiến hành phản ứng với nồng độ các mồi bằng nhau và bằng 0.4 µM. Với phản ứng mPCR 1, các vạch của mồi bexA, lytA rất mờ trong khi ba vạch còn lại đậm hơn nhiều. Các vạch nhạy hơn có thể lấn át các sản phẩm kém nhạy hơn. Do đó, chúng tôi đã giảm thể tích mồi xuống 0.1 µM và thử nghiệm các nồng độ tăng dần 0,5µM.
a. Phản ứng mPCR 1
Phản ứng mPCR 1, chúng tôi thử nghiệm trên 5 nồng độ mồi là 0,1μM; 0,15μM; 0,2μM; 0,25μM; 0,3μM (hình 3.7A). Theo đó, tại giếng 1 và giếng 5 có băng vạch phụ ở kích thước thấp do mồi thừa chưa bắt cặp. Giếng 2, 3, 4 cho các vạch rõ nét và đúng kích thước mong muốn. Do đó, chúng tôi chọn nồng độ mồi 0,2μM làm nồng độ tối ưu.
Hình 3.7A: Kết quả điện di tối ưu nồng độ mồi phản ứng mPCR 1
M: thang marker. Giếng 1, 2, 3, 4, 5 tương ứng với các nồng độ: 0,1μM; 0,15μM; 0,2μM; 0,25μM; 0,3μM.
b. Phản ứng mPCR 2
Phản ứng mPCR 2, chúng tôi thử nghiệm trên 5 nồng độ mồi là 0,1μM; 0,15μM; 0,2μM; 0,25μM; 0,3μM. Kết quả điện di kiểm tra được thể hiện trên hình.
462 bp 230 bp 140 bp 89 bp
Với các nồng độ đã thử nghiệm, các băng vạch kết quả đều rõ nét và đúng kích thước. Ở giếng 4 và 5, vạch phụ kích thước khoảng 200 bp hiện rõ nét hơn. Do đó, chúng tôi chọn nồng độ mồi tối ưu là 0,2μM.
Hình 3.7B: Kết quả điện di tối ưu nồng độ mồi phản ứng mPCR 2
M: thang marker. Giếng 1,2, 3, 4, 5 tương ứng với các nồng độ: 0,1μM; 0,15μM; 0,2μM; 0,25μM; 0,3μM.
C. Tối ƣu nồng độ MgCl2
Nồng độ MgCl2 hay nồng độ Mg2+ là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến kết quả của phản ứng PCR. Mg2+ đóng vai trò như một cofactor, tác động đến hoạt động của enzyme Taq polymerase, giúp Taq polymerase có thể thực hiện chức năng của mình một cách hiệu quả.
a.Phản ứng mPCR1
Theo như kết quả trên hình ảnh điện di, ở giếng 1, chỉ có 2 băng vạch của BA và CA. Giếng 2 và 3 còn vạch phụ với kích thước khoảng 700 bp. Giếng 4 và 5 cho các băng rõ nét, đúng kích thước. Do đó, chúng tôi lựa chọn nồng độ MgCl2 là 2,5mM.
379 bp 276 bp 147 bp 95 bp 462 bp
Hình 3.8A: Kết quả điện di tối ưu nồng độ MgCl2 phản ứng mPCR 1
M: thang marker. Giếng 1, 2, 3, 4, 5 tương ứng với các nồng độ: 1mM; 1,5 mM; 2mM; 2,5mM; 3mM.
b.Phản ứng mPCR2
Kết quả khảo sát nồng độ MgCl2 tối ưu cho phản ứng mPCR 2 được biểu diễn ở hình dưới. Chúng tôi thử nghiệm trên 5 nồng độ là 1mM; 1,5mM; 2mM; 2,5mM; 3mM. Các nồng độ 1,5mM; 2mM; 2,5mM; 3mM đều cho các băng vạch kết quả có kích thước phù hợp. Chúng tôi chọn nồng độ 2,5mM cho các bước tối ưu tiếp theo.
Hình 3.8B: Kết quả điện di tối ưu nồng độ MgCl2 phản ứng mPCR 2
M: thang marker. Giếng 1, 2, 3, 4, 5 tương ứng với các nồng độ: 1mM; 1,5mM; 2mM; 2,5mM; 3mM.
D.Tối ƣu nồng độ dNTPs
dNTPs là nguyên liệu để tổng hợp nên sản phẩm cho phản ứng PCR. Nếu nồng độ dNTPs quá thấp, đặc biệt trong phản ứng PCR, thì sản phẩm được tạo
379 bp 276 bp 147 bp 95 bp
thành với số lượng thấp, không đủ để phát hiện. Ngược lại, nếu nồng độ dNTPs quá cao sẽ có tác động tiêu cực lên phản ứng. Do dNTPs có thể gắn với ion Mg2+ nên có thể ảnh hướng tới hoạt động hỗ trợ của ion này lên enzyme Taq polymerase. Trong nghiên cứu này, chúng tôi giữ nguyên nồng độ Mg2+
cho kết quả tốt nhất trên cơ sở thực nghiệm với nồng độ dNTPs theo các mức 200 µM, 250 µM và 300 µM.
a. Phản ứng mPCR 1
Trong phản ứng 1, chúng tôi thử nghiệm 5 nồng độ dNTPs là 0,1mM; 0,2mM; 0,3mM; 0,4mM. Theo như kết quả điện di trên hình 3. 9A, ở giếng 1 (0,1mM), không có các băng vạch sản phẩm. Giếng 5 (0,5mM), các vạch không rõ nét. Chúng tôi lựa chọn nồng độ 0,2mM cho các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.9A: Kết quả điện di tối ưu nồng độ dNTPs phản ứng mPCR 1
M: thang marker. Giếng 1, 2, 3, 4, 5 tương ứng với các nồng độ: 0,1mM; 0,2mM; 0,3mM; 0,4mM; 0,5mM.
b. Phản ứng mPCR 2
Chúng tôi tiến hành thử nghiệm 5 nồng độ dNTPs cho phản ứng mPCR 2. Kết quả điện di được thể hiện trên hình 3.9B. Các giếng 1, 2, 3, 4 đều có băng vạch lên rõ và đúng kích thước. Chúng tôi chọn nồng độ dNTPs 0,2 mM làm nồng độ tối ưu.
Hình 3.9B: Kết quả điện di tối ưu nồng độ dNTPs phản ứng mPCR2
462 bp 230 bp 140 bp 89 bp 379 bp 276 bp 147 bp 95 bp
M: thang marker. Giếng 1, 2, 3, 4, 5 tương ứng với các nồng độ: 0,1mM; 0,2mM; 0,3mM; 0,4mM; 0,5mM.
E.Tối ƣu nồng độ Taq polymerase
Trong phản ứng PCR, enzyme xúc tác cho quá trình tổng hợp sản phẩm là thành phần không thể thiếu. Trong chuyên đề này chúng tôi sử dụng enzyme Taq polymerase, là enzyme thông dụng nhất được sử dụng trong PCR. Nồng độ enzyme Taq polymerase có ảnh hưởng rất nhiều đến kết quả phản ứng mPCR. Nếu nồng độ enzyme quá thấp sẽ không đủ để khuếch đại sản phẩm mong muốn. Ngược lại, nếu nồng độ enzyme quá cao sẽ gây ra sự mất cân bằng về tín hiệu giữa các đoạn sản phẩm.
a. Phản ứng mPCR 1
Thử nghiệm trên 5 nồng độ Taq polymerase khác nhau là: 0,6U; 1U; 1,25U; 1,5U và 1,6U. Kết quả điện di kiểm tra được thể hiện trên hình 3.10A. Giếng số 1 (nồng độ 0,6U) cho các băng vạch rõ nét và đúng kích thước. Các giếng còn lại, các vạch kết quả bị nhiễu và có vạch phụ. Do đó chúng tôi chọn nồng độ Taq polymerase là 0,6U cho các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.10A: Kết quả điện di tối ưu nồng độ Taq polymerase phản ứng mPCR 1
M: thang marker. Giếng 1, 2, 3, 4, 5 tương đương với các nồng độ: 0,6U; 1U; 1,25U; 1,5U và 1,6U.
b. Phản ứng mPCR 2
Phản ứng mPCR 2, chúng tôi thử nghiệm các nồng độ 1U; 1,25U; 1,5U; 1,8U; 2U. Kết quả được thể hiện ở hình 3.10B. Theo đó, các giếng đều cho băng vạch rõ
462 bp 230 bp 140 bp 89 bp
nét, đúng kích thước. Giếng số 4 (nồng độ 1,8U), không có các băng vạch phụ như các giếng còn lại. Do đó, chúng tôi chọn nồng độ Taq polymerase tối ưu là 1,8U.
Hình 3.10B: Kết quả điện di tối ưu nồng độ Taq polymerase phản ứng mPCR 2
M: thang marker. Giếng 1, 2, 3, 4, 5 tương ứng với các nồng độ: 1U; 1,25U; 1,5U; 1,8U; 2U.
3.3.4.2. Tóm tắt điều kiện thực hiện kỹ thuật mPCRs
Từ kết quả tối ưu nồng độ các thành phần phản ứng mPCRs và nhiệt độ chúng tôi lựa chọn thành phần phản ứng mPCRs với nồng độ cuối cùng như sau: