D. Tách chiết và tinh sạch DNA từ mẫu bệnh nhầy họng theo phƣơng pháp « BOOM »
B. Công thức tính độ nhậy và độ đặc hiệu
+ Độ nhạy = a/ a+c + Độ đặc hiệu = d/b+d
+ Giá trị dự đoán âm tính (negative predictive value): NPV = d/d+c + Giá trị dự đoán dương tính (positive predictive value): PPV = a/a+b
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Kết quả thu thập và tuyển chọn chủng N. meningitidis, H. influenzae và
S. pneumonia(phụ lục 1)
Chủng Neisseria meningitidis được tuyển chọn, phân lập từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng của bệnh nhân (dịch não tủy, máu…), và từ nhầy họng người mang mầm bệnh không triệu chứng lâm sàng, chủng quốc tế thuộc nhóm huyết thanh (A: 01 chủng, B: 01 chủng C: 01 chủng, W135 và X: 01 chủng). Kiểm tra chủng bằng kỹ thuật định danh vi khuẩn trên thanh NH với 30 tính chất sinh vật hóa trên máy Vitex2 - Pháp và xác định nhóm huyết thanh bằng kỹ thuật PCR.
Trong nghiên cứu này việc xác định cơ cấu nhóm của N. meningitidis bằng kỹ thuật mPCR cho thấy các chủng phân lập từ bệnh nhân (mẫu: DNT, máu, ban hoại tử…) và nhầy họng của người mang mầm bệnh không triệu chứng chủ yếu là nhóm B và thấp hơn là sự lưu hành của nhóm C, chưa thấy phát hiện ở các nhóm khác trong 12 nhóm huyết thanh của N. meningitidis.
Toàn bộ các chủng H. influenzae phân lập từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng (máu, dịch phế quản của bệnh nhân được chẩn đoán viêm phổi cấp tính và nhiễm khuẩn huyết). Chủng định danh xác định H. influenzae có độ tin cậy từ 93,0% - 99%. Để thực hiện thiết kế mồi cho phát hiện serotype b chủng sẽ được kiểm chứng cùng với chủng chuẩn và kháng huyết thanh kháng serotype b. Kết quả kiểm tra 25 chủng sử dụng trong nghiên cứu chỉ có chủng Hib quốc tế và chủng 6548d-4 phân lập từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng thuộc serotype b.
Các chủng S. pneumoniae do Viện VSDTTW và Viện nhi Trung ương cung cấp đã được phân lập trên mẫu bệnh phẩm lâm sàng (dịch phế quản và máu), kết quả kiểm tra tính chất SVHH trên máy định danh Vitex 2 có độ tin cậy từ 94,0% - 99,0%.
Các chủng sử dụng trong nghiên cứu để đánh giá độ đặc hiệu của các phản ứng mPCRs, các chủng này thuộc các họ Staphylococcus, Streptococcus, Neisseria, Haemophilus phân lập từ mẫu bệnh phâm lâm sàng từ bệnh nhân.
3.2. Kết quả khảo sát gene đặc hiệu phát hiện N. meningitidis; H. influenzae và S. pneumoniae bằng kỹ thuật PCR cơ bản S. pneumoniae bằng kỹ thuật PCR cơ bản
3.2.1. Kết quả khảo sát gene đặc hiệu phát hiện N. meningitidis; H. influenzae
và S. pneumoniae
Khảo sát gene đích trên các chủng của 03 loài vi khuẩn lây truyền qua đường hô hấp, gây bệnh cảnh lâm sàng chủ yếu là viêm màng não, viêm phổi cấp tính và nhiễm khuẩn huyết. Các chủng này phân lập từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng ca bệnh (máu, dịch não tủy, dịch phế quản...) và trên người mang mầm bệnh không triệu chứng (dịch nhầy họng). Sản phẩm gene ctrA (Nm - 257bp ) Sản phẩm gene crgA (Nm - 230bp) Sản phẩm gene porA (Nm - 158bp)
Gene bexA (Hib) - 181 bp Gene ply (Sp) - 795 bp Gene lytA (Sp) -168bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 10 1112131415161718 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 10 1112131415161718 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M 10 111213141516 17 18
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 M 9 10 11 12131415 1 2 3 4 5 6 7 8 M 9 10 11 12 13 14 15
181 bp
Hình 3.1: Sản phẩm gene đích của N. meningitidis; H. influenzae và S. pneumoniae
Bảng 3.1: Kết quả khảo sát các gene khác nhau phát hiện N. meningitidis;
H. influenzae và S. pneumoniae
Chủng Số
chủng
Vùng gene khảo sát (+) / tổng số mẫu xét nghiệm
ctrA porA sodC crgA bexA ply lytA