- Mẫu bệnh phẩm lâm sàng ca bệnh ( DNT, máu, nhày họng, tử ban, dịch phế quản…)
- Mẫu người tiếp xúc gần ca bệnh ( nhầy họng)
- Chủng cung cấp: chủng quốc tế, phân lập bảo quản tại phòng xét nghiệm. - Nguồn chủng: Viện VSDTTW, Viện nhi TW, Viện YHDPQĐ, Viện 103, Viện YSNĐ-TTNĐVN.
- Nm: Cấy trên môi trường chocolate có kháng sinhVCN – (Vancomycine + Colistin + Nistatin) trong điều kiện 5% CO2/ 370C/ 24 giờ.
- Hi: cấy trên thạch chocolate
- Sp: phân lập trên môi trường thạch máu.
- Kỹ thuật: quan sát hình thể khuẩn lạc, nhuộm gram, thử nghiệm oxydase.
- Đinh danh Nm và Hi trên thẻ NH và Sp trên thẻ GP trên máy Vitex 2.
- Xác định serogroups của Nm bằng kỹ thuật PCR.
- Xác định serotype của Hi bằng realtime-PCR và kháng huyết thanh.
Khảo sát gene đích bằng kỹ thuật PCR:
+ Nm: ctrA, crgA, sodC, porA và serogroups A (sacD- myn), serogroup B (siaDb), serogroup C (siaDc).
Hib, Sp nhóm huyết thanh A, B, C
Sơ đồ 2.2: Qui trình sản xuất sinh phẩm mPCR 1 và mPCR 2
2.3.2. Qui trình, kỹ thuật tuyển chọn chủng nghiên cứu
- Các chủng vi khuẩn được cung cấp sẽ được kiểm tra và định danh trên máy Vitek 2. + Chủng N. meningitidis, H. influenzae và S. pneumoniae phân lập trên môi trường chocolate và thạch máu.
+ Quan sát hình thái khuẩn lạc, nhuộm gram, và thử nghiệm oxydase...
+ N. meningitidis và H. influenzae sẽ được định danh trên thanh NH (dùng cho vi khuẩn gram (-).
+ S. pneumoniae được định danh trên thanh GP dùng cho vi khuẩn gram(+). - Tiến hành tách chiết DNA.
2.3.3. Qui trình tách chiết DNA từ khuẩn lạc và từ bệnh phẩm lâm sàng (theo CDC) A. Pha hóa chất : A. Pha hóa chất :
Dung dịch TE (10mM tris HCl; pH 8,0; 0,1 EDTA) : 1. Lấy 10 ml dung dịch 0,1 M tris-HCl, pH: 8,0.
2. Lấy 1 ml dung dịch 0,1 M EDTA, pH 8,0.
3. Cho vừa đủ 100 ml nước cất khử ion, vô trùng và lắc đều. 4. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.
Dung dịch Tris- HCl (10 mM,pH : 8,0) 1. Lấy 10 ml dung dịch 0,1M tris-HCl.
2. Lấy 90 ml nước cất khử ion, vô trùng và lắc đều. 3. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.
Dung dịch Lysis (4% SDS, 10 mM EDTA, pH: 8,0) 1. Lấy 20 ml dung dịch SDS 20%.
2. Lấy 10 ml EDTA nồng độ 0,1 M, pH: 8,0
3. Cho 100 ml nước cất, vô trùng vào hỗn dịch, lắc đều. 4. Bảo quản ở nhiệt độ phòng.
1. Hoàn nguyên ống đông khô enzyme mutanolysin bằng nước cất khử ion vô trùng để có nồng độ 2.500 U/ml.
2. Chia vào các tube nhựa vô trùng có nắp đậy. 3. Bảo quản ở - 200C.
Pha enzyme working Mutanolyse (10.000 U/ml):
1. Lấy 3,3 ml dung dịch TE cho vào tube chứa dung dịch bảo quản 3.000U/ml (stock) 2. Chia 100 µl/ 1 tube để bảo quản.
3. Bảo quản ở -200C,
Pha Hyaluronidase (100 mg): 1. Lấy 3,3 ml dung dịch TE.
2. Cho vào tube tạo ra dung dịch enzyme 30 mg/ml (dạng stock). 3. Chia đều ra các tube, mỗi tube 500µl, bảo quản ở -200C.
Dung dịch hoạt hóa (Digestion) (0,04 g/ml lysozyme và 75 U/ml mutanolysin pha trong dung dịch TE:
1. Lấy 1 ml dung dịch TE bao gồm lysozyme và mutanolysin và 40 mg lysozyme đông khô vào tube loại 1,5 ml.
2. Cho vào 1 ml TE.
3. Lấy 30 µl dung dịch stock của mutanolysin (2500 U/ml).
Ghi chú: chuẩn bị dung dịch này trong thời gian 15 phút trước khi sử dụng và không sử dụng lại.
B. Qui trình tách DNA từ khuẩn lạc đối với vi khuẩn gram (-) nhƣ: