D. Tách chiết và tinh sạch DNA từ mẫu bệnh nhầy họng theo phƣơng pháp « BOOM »
a. Phản ứng mPCR
độ nóng chảy trong khoảng 600C. Nhiệt độ bắt cặp cần phải được điều chỉnh dựa theo nhiệt độ nóng chảy trong thiết kế. Thông thường, nhiệt độ bắt cặp của mồi nhỏ hơn nhiệt độ nóng chảy khoảng 2 đến 50C và cần được kiểm chứng bằng thực nghiệm. Trong phản ứng mPCR, nhiệt độ bắt cặp mồi là một yếu tố rất quan trọng. Do có nhiều cặp mồi trong một phản ứng, nhiệt độ bắt cặp cần được tối ưu sao cho có thể mang lại kết quả tốt nhất, cân bằng giữa các cặp mồi khác nhau.
a. Phản ứng mPCR 1
Phản ứng mPCR 1, sau khi tính toán, chúng tôi tiến hành thử nghiệm với các nhiệt độ sau: 520
C, 540C, 560C, 580C, 600C (Hình 3.6A). Giếng 1 có vạch phụ với kích thước khoảng 600 bp. Ở giếng 4 và 5, vạch sản phẩm PA không rõ nét. Trong khi đó, ở giếng 2 và 3, các vạch sản phẩm đều lên rõ và đúng kích thước. Do đó, chúng tôi lựa chọn nhiệt độ 560
C cho các thí nghiệm tiếp theo. 147bp
2 76bp 379bp 379bp
Hình 3.6A: Kết quả điện di tối ưu nhiệt độ gắn mồi phản ứng mPCR1
M: thang marker. Giếng 1, 2, 3, 4, 5 tương ứng với các dải nhiệt độ 520C; 540C, 560C, 580C, 600C.
b. Phản ứng mPCR2
Phản ứng 2, chúng tôi thử nghiệm trên 5 nhiệt độ bắt cặp khác nhau là: 52oC, 540C, 560C, 580C, 600C. Kết quả điện di kiểm tra được thể hiện trên hình 3.6B. Theo đó, với các nhiệt độ bắt cặp đã thử nghiệm, các vạch kết quả đều lên rõ nét và đúng kích thước. Ở giếng 4 và 5, vạch phụ hơi đậm hơn so với giếng, trên cơ sở thực nghiệm chúng tôi chọn mức 560C cho các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 3.6B: Kết quả điện di tối ưu nhiệt độ gắn mồi phản ứng mPCR 2
462 bp 230 bp 140 bp 89 bp 379 bp 276 bp 147 bp 95 bp
M: thang marker. Giếng 1, 2, 3, 4, 5 tương ứng với các dải nhiệt độ 520C; 540C, 560C, 580C, 600C.