D. Tách chiết và tinh sạch DNA từ mẫu bệnh nhầy họng theo phƣơng pháp « BOOM »
N. meningitidis (+/tổngmẫu)
3.3.1. Giải trình tự một số vùng gene đích phát hiện N meningitidis; H influenzae và S pneumoniae.
Giải trình tự các vùng gene đích từ một số chủng nghiên cứu lưu hành tại Việt Nam:
+ Thiết kế mồi giải trình tự gene: ctrA trên trình tự M80593 MB02 – NCBI, sản phẩm 890bp, crgA trên trình tự emb gb|AF190471 và gb|CP001561.1, sản phẩm 566 bp; porA trên trình tự X78467.1-NCBI|, sản phẩm 1159 bp. (phụ lục 2)
+ Thiết kế mồi giải trình tự gene siaDb và siaDc trên trình tự gb|AE002098.2| emb|AM421808.1 của ngân hàng gene NCBI; sản phẩm là: 555 bp và 621 bp. (phụ lục 2)
+ Thiết kế mồi giải trình tự bexA trên trình tự gb|AF549213.1-NCBI, sản phẩm 680 bp. (phụ lục 2)
+ Thiết kế mồi giải trình tự ply và lytA trên trình tự X52474 ; AE00839 và AJ243399.1 –NCBI; sản phẩm 796 và 906 bp. (phụ lục 2)
- Giải trình tự các vùng gene đích:
+ Giải trình tự các gene đích trên DNA đã được tách chiết và tinh sạch từ một số chủng vi khuẩn đại diện có nguồn gốc phân lập từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng và người mang mầm bệnh không triệu chứng.
+ Khuếch đại sản phẩm vùng gene tương ứng với các cặp mồi bằng kỹ thuật PCR cơ bản với chu kỳ nhiệt tương ứng với tỷ lệ % GC có trong trình tự mồi.
+ Sản phẩm PCR của gene đích được điện di trên thạch, kích thước sản phẩm phải tương thích theo thiết kế. Band tương thích trên thạch sẽ cắt ra, được tinh sạch trên cột UNIQ-10 (Sangon, Shanghai, China). Mẫu DNA sẽ được thực hiện bằng phản ứng LightCycle với mồi xuôi và mồi ngược riêng biệt trên máy điều nhiệt với 20 chu kỳ. Sản phẩm của phản ứng LightCycle sẽ được giải trình tự trên máy Sequencing ABI 3310 Analyzic. Phân tích trình tự gene trên phần mềm primer 3.0.
Trên cơ sở khảo sát vùng gene đích của vi sinh vật, đây là cơ sở lựa chọn vùng gene phù hợp với chủng vi sinh vật lưu hành ở Việt Nam. Sau khi lựa chọn vùng gene tiến hành giải trình tự vùng gene cần nghiên cứu của mỗi loại tác nhân sinh học, trên cơ sở giải trình tự sẽ thiết kế mồi đặc hiệu cho các phản ứng mPCR
phát hiện các tác nhân vi sinh vật. Để giải trình tự gene cần thiết kế các cặp mồi giải trình tự trên các mã gene tương ứng với vùng gene trên ngân hàng gene NCBI, lựa chọn các cặp mồi bằng phần mềm Primers 5.0. Các trình tự mồi thiết kế được Blast và được thử nghiệm tối ưu hóa các phản ứng PCR trước khi giải trình tự gene.