D. Tách chiết và tinh sạch DNA từ mẫu bệnh nhầy họng theo phƣơng pháp « BOOM »
N. meningitidis (+/tổngmẫu)
3.3.2. Kết quả thiết kế mồi cho phản ứng mPCRs A Phản ứng mPCR 1:
A. Phản ứng mPCR 1:
Thiết kế mồi cho phản ứng mPCR 1 phát hiện 03 tác nhân vi khuẩn gây hội chứng viêm màng não và bệnh đường hô hấp... (N. meningitidis, H. influenzae týp b và S. pneumoniae) dựa trên giải trình tự vùng gene đích như sau:
- Đối với N. meningitidis sử dụng 02 gene đích: ctrA và porA.
- Phát hiện H. influenzae serotype b trên gene đích bexA.
- Phát hiện S. pneumoniae trên gene lytA hoặc ply.
Bảng 3.4. Trình tự mồi thiết kế cho phản ứng mPCR 1
TT Tên mồi Trình tự mồi 5’-3’ Sản phẩm (bp)
1
CtrA F (CA-F) GGTGGTGGCCTTTCTTCGAT
140 CtrA F (CA-R) TGAACCTGACCAGGCGTTTT
2 PorA F (PA-F) GCCGCATCAGGACGAAAATC 462
PorA F (PA-R) AATACACATCCGATCCGGGC
3 BexA F (BA-F) AGCCTCCAACAAGTGGTACG 89
BexA F (BA-R) CCCTGTTAAGCTGCCTTGGA
4 LytA F (LA-F) AGGTCACTGCAAGGAAGGTC 230
LytA F (LA-R) GATGACCGTTGGTACGCCA
+ 02 cặp mồi trên gene ctrA và porA phát hiện N. meningitidis trên trình tự nucleotids của các chủng 34A1-F.seq; 144A1-F.seq; Duy-DNTA1-F.seq và KhoaA1-F.seq.(Phụ lục 3).
+ 01 cặp mồi trên gene bexA (phát hiện H. influenzae týp b) trên giải trình tự nucleotids chủng: H-BexF _F03 _150423_MUN_011.seq và H-BexR_G03_150423_ MUN_013.seq. (phụ lục 3)
+ 01 cặp mồi trên gene lytA phát hiện S. pneumoniae trên giải trình tự nucleotis chủng: SP-LytAF_H03_150423_MUN_015.seq và SP-LytAR_A04_150423_MUN _002.seq. (Phụ lục 3)
+ Thực hiện phản ứng mPCR 1 với nồng độ cuối cùng: dung dịch đệm PCR 1X (50mM KCl, 10mM Tris-HCl), MgCl2: 2,5mM, dNTPs: 0,2mM, Taq polymerase: 0,6U. Chu kỳ nhiệt: 950C/5 phút, 30 chu kỳ (950C/30 giây, 560C/60 giây, 720C/60 giây), 720C/7 phút, 40C - ∞.
Trong nghiên cứu sử dụng 02 gen đích ctrA và porA đặc hiệu phát hiện
N. meningitidis, ctrA thuộc vùng C có chức năng vận chuyển capsule đến bề mặt tế bào, có tính bảo thủ cao và thường được sử dụng trong các phản ứng PCR [18]. Tuy nhiên theo một số nghiên cứu đã thông báo có tỷ lệ không dưới 16% chủng não mô cầu mất gene ctrA ở người mang mầm bệnh không triệu chứng [22]. PorA mã hóa lớp 1- OMP (outer member protein) là gene mã hóa kháng nguyên phân biệt serosubtyp của N. meningitidis [23]. Do đó việc sử dụng đồng thời 02 gene đích trong một phản ứng PCR nhằm hạn chế tối đa khả năng bỏ sót các chủng không có
ctrA và đủ khả năng phát hiện N. meningitidis thuộc nhóm không xác định (nonserogroups) [28].
Hầu hết các nghiên cứu phát hiện H. influenzae bằng các kỹ thuật mPCR hoặc realtime - PCR thường thiết kế mồi trên bexA, đây là gene có chức năng mã hóa capsule và để phân biệt 6 serotype (a, b, c, d, e, f), nhận định cho thấy việc độ nhậy để phát hiện Hib thấp hơn hơn so với Hia, Hic, và Hid và không phát hiện được Hie, Hif, hoặc HiNT [18,20].
Thiết kế mồi chủ yếu trên ply mã hóa pneumolysin có chức năng ly giải tế bào vật chủ và hoạt hóa bổ thể hoặc lytA mã hóa autolysin có chức năng hoạt hóa, dung giải protein, giải thoát vi khuẩn khỏi tế bảo vật chủ [18,20]. Trong nghiên cứu này trình tự mồi phát hiện S. pneumoniae được thiết kế trên lytA.
B.Phản ứng mPCR 2:
Thiết kế mồi cho phản ứng mPCR 2 chúng tôi lựa chọn ba nhóm huyết thanh thường gây bệnh ở Việt Nam là A, B và C dựa trên vùng gene đích như sau:
-Chứng nội chẩn IC (internal control) được thiết kế trên giải trình tự gene
- Phát hiện nhóm A của N. meningitidis trên trình tự GenBank accession no._003116 trên ngân hàng gene NCBI, có chiều dài 865bp.
- Phát hiện nhóm B của N. meningitidis trên giải trình tự gene siaDb có chiều dài 532 bp.
- Phát hiện nhóm C của N. meningitidis trên giải trình tự gene siaDc có chiều dài 751 bp.
Bảng 3.5: Trình tự mồi thiết kế cho phản ứng mPCR 2
TT Tên mồi Trình tự mồi 5’-3’ phẩm Sản
(bp)
1 Internal control – CrgA (IC-F) TTTAGGCTTCACCGAACCCG 147 Internal control – CrgA (IC-R) AAGCAAGCAATACCGCAACC
2 SacD F (SA-F) AACAGGGTTTGTAACTGGCTT 95
SacD F (SA-R) CTTCACAGCCATAGCCAAGAAA
3 SiaDb F (SB-F) TAGTGGCCTGTACAGCA 276
SiaDb F (SB-R) AGGTCAGCTTAACCAAGTCCA
4 SiaDc F (SC-F) GCGGTAGTAGGGGCAAGTAA 379
SiaDc F (SC-F) CATTCAGGCGGGATTAGCAC
+ Chứng nội chẩn (IC): 01 cặp mồi được thiết kế trên gene crgA phát hiện N. meningitidis trên giải trình tự gene của chủng 34A-F.seq; 144A-f.seq; Duy /DNTA- F.seq và KhoaA1-F.seq. (Phụ lục 3).
+ 01 cặp mồi được thiết kế trên trình tự gene sacD phát hiện nhóm A trên ngân hàng gene NCBI.
+ 01 cặp mồi thiết kế trên trình tự gene siaDb đặc hiệu cho nhóm B trên trình tự gene chủng DNTB-F.seq và 144B-F.seq. (Phụ lục 3).
+ 01 cặp mồi thiết kế trên gene siaDc đặc hiệu cho nhóm C trên trình tự gene của chủng 37C-F.seq, 37C-R.seq; 152C-F.seq, 152C-R.seq. (Phụ lục 3).
+ Thực hiện phản ứng mPCR 2 với nồng độ cuối cùng: dung dịch đệm PCR 1X (50mM KCl, 10mM Tris-HCl), MgCl2: 2,5mM, dNTPs: 0,2mM, Taq
polymerase: 0,8U; 0,2µM mồi mỗi loại. Chu kỳ nhiệt: 950C/5 phút, 30 chu kỳ (950C/30 giây, 560C/60 giây, 720C/60 giây), 720C/7 phút, 40C - ∞.
A B
Hình 3.3A: Kết quả điện di mPCR 1với giếng 1: porA (462bp), ctrA (140 bp),
giếng 2: lytA (230 bp), giếng 3: bexA (89bp), giếng 4: chứng dương;thang marker.
Hình 3.3B: Hình ảnh điện di mPCR 2 vớithang marker, giếng 5: chứng dương,
giếng 6: crgA (147 bp) và nhóm A (myn- 95 bp), giếng 7: crgA và nhóm B (siaDb - 276 bp), giếng 8: crgA và nhóm C (siaDc - 379bp).
Thiết kế mPCR 2 trên sacD (myn), siaDb và siaDc phát hiện 03 nhóm A, B và C. Chứng nội tại IC được thiết kế trên crgA. Gene crgA thường được sử dụng để xác định nhiễm N. meningitidis trên mẫu bệnh phẩm lâm sàng và trên mẫu nhầy họng của người mang mầm bệnh không triệu chứng, gene này luôn luôn ổn định, theo khảo sát của chúng tôi trên 33 chủng N. meningitidis phân lập được thì đều có vùng gene này. Trong thiết kế trong phản ứng mPCR 2 thì chúng tôi sử dụng crgA
như là một chứng nội tại (IC) giúp cho nhận định đánh giá nhóm của N. meningitidis
462 bp 230 bp 140 bp 89 bp 379 bp 276 bp 147 bp 95 bp 1 2 3 4 M 5 6 7 8
với điều kiện bắt buộc crgA dương tính, trong điều kiện không có band đặc hiệu tương ứng với crgA thì cần xem xét và thực hiện lại phản ứng mPCR 2.