D. Tách chiết và tinh sạch DNA từ mẫu bệnh nhầy họng theo phƣơng pháp « BOOM »
N. meningitidis 32 32/32 31/32 29/32 32/32 KL KL KL
H. influenzae 23 KL KL KL KL 04/23 KL KL
S. pneumoniae 15 KL KL KL KL KL 15/15 15/15
Ghi chú: KL: không làm
Trong tổng số 99 chủng bước đầu được lựa chọn, sau khi kiểm tra chủng bằng các kỹ thuật định danh, realtime – PCR... chúng tôi tiến hành khảo sát 70 chủng vi khuẩn gây bệnh đường hô hấp (N. meningitidis; H. influenzae và S. pneumoniae)
Từ kết quả bảng nghiên cứu: Khảo sát các vùng gene đích trên 32 chủng N. meningitidis, cho thấy 32/32 chủng biểu hiện vùng gene ctrA và crgA. Vùng gene
porA biểu hiện ở 31/32 chủng và SodC là 29/32 chủng. Trong 23 chủng H.influenzae
sử dụng trong nghiên cứu có 04 chủng có gene bexA thuộc về nhóm chủng quốc tế (týp a, b, c) và chỉ có 01 chủng H. influenzae phân lập ở Việt Nam dương tính còn lại các chủng khác có kết quả điện di không tương thích với sản phẩm mồi thiết kế là 181 bp. Kết quả nghiên cứu khảo sát này phù hợp với kết quả định týp của H. influenzae của chúng tôi bằng kỹ thuật Realtime - PCR phát hiện có 1/23 chủng phân lập được là týp b, còn lại 22 chủng là H. influenzae thuộc các týp a, c, d, e, f. Nghiên cứu của tác giả G. Tzanakaki và cộng sự (2005) thì có bắt cặp với H. influenzae týp c, nhưng trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng chính cặp mồi này của tác giả thì vẫn thấy bắt cặp không đặc hiệu với týp c và cả týp a, f của H. influenza, điều này chứng minh cặp mồi này có độ đặc hiệu không cao. Khảo sát 02 cùng gene đích (ply và lytA) phát hiện S. pneumoniae cho thấy 15 chủng đều có cả 02 vùng gene này.
Kết quả khảo sát gene đích phát hiện 03 tác nhân vi khuẩn gây bệnh đường hô hấp cho thấy có thể sử dụng các gene đích ctrA; crgA; porA; sodC đặc hiệu cho phát hiện N. meningitidis, và ply và lytA để phát hiện S. pneumoniae. Gene bexA cần
thiết kế lại trên giải trình tự gene của chủng Việt Nam để bảo đảm độ tin cậy trong các phản ứng Multiplex-PCR.
Bảng 3. 2: Kết quả khảo sát gene đích phát hiện N. meningitidis từ chủng phân lập
có nguồn gốc khác nhau
Nguồn gốc chủng Số chủng
Vùng gene khảo sát N. meningitidis
(+/tổngmẫu)
ctrA porA sodC crgA
Quốc tế 06 06/06 06/06 06/06 06/06 Dịch não tủy* 02 02/02 01/02 01/02 02/02 Dịch nhầy họng** 21 21/21 21/21 20/21 21/21 Máu* 01 01/01 01/01 01/01 01/01 Không xác định 02 02/02 02/02 01/02 02/02 Tổng 32 32/32 31/32 29/32 32/32
Ghi chú: * mẫu bệnh phẩm lâm sàng; ** mẫu người mang mầm bệnh
Kết quả bảng trên cho thấy: gene ctrA và crgA biểu hiện đầy đủ ở các chủng phân lập từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng và người mang mầm bệnh không triệu chứng; gene sodC và porA không phát hiện thấy ở cùng 01 chủng phân lập từ dịch não tủy của bệnh nhân và sodC không thấy ở một chủng không xác định được nguồn gốc phân lập được.
Sự thay đổi gene trong nhiễm sắc thể dẫn đến sự thay đổi cấu trúc của capsule polysaccharid (CPS) trong các nhóm của N. meningitidis. Đặc trưng của các gene mã hóa capsule bao gồm các vùng A, B, C, D và E. Gene ctrA thuộc vùng C, có chức năng vận chuyển capsule đến bề mặt tế bào, có tính bảo thủ cao và thường được sử dụng trong các phản ứng PCR [20]. Tuy nhiên theo một số nghiên cứu đã thông báo có tỷ lệ không dưới 16% chủng não mô cầu mất gene ctrA ở người mang mầm bệnh không triệu chứng [20]. Trong nghiên cứu khảo sát trên 32 chủng N. meningitidis phân lập từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng và người mang mầm bệnh không triệu chứng. Kết quả cho thấy toàn bộ các chủng N. meningitidis đều có gene ctrA.
SodC không thuộc vùng gene mã hóa capsule, có chức năng mã hóa vỏ của vi khuẩn (encapsulated), thường được sử dụng phát hiện N. meningitidis ở người mang mầm bệnh không triệu chứng khi gene ctrA cho kết quả âm tính [23]. PorA
meningitidis [22]. Trong nghiên cứu này cho thấy có 31/32 chủng N. meningitidis
đều có porA và 29/32 chủng có sodC. Gen crgA là gene điều hòa, chuyển hóa của
N. meningitidis, có chức năng tạo sự tương tác giữa tác nhân gây bệnh với tế bào biểu mô của người hay còn được gọi là thụ thể tự nhiên, hoạt hóa và khởi động, định hướng các gene khác. Trong nghiên cứu khảo sát crgA trên 32 chủng N. meningitidis, chúng tôi đều thấy xuất hiện của vùng gene này.
Trên cơ sở nghiên cứu khảo sát gene trên cho thấy rằng có thể sử dụng thiết
kế các cặp mồi trên các gene đích (ctrA; crgA; porA và sodC) để phát hiện
N. meningitidis trên mẫu bệnh phẩm lâm sàng ca bệnh và mẫu bệnh phẩm của người mang mầm bệnh không triệu chứng.
3.2.2. Kết quả khảo sát gene đặc hiệu xác định nhóm huyết thanh A, B, C của