D. Tách chiết và tinh sạch DNA từ mẫu bệnh nhầy họng theo phƣơng pháp « BOOM »
B. Thiết kế mồi trong nghiên cứu:
a. Thiết kế mồi cho mPCR 1 (phát hiện 3 tác nhân Nm, Hib, Sp): tổng số 4 trình tự mồi
+ Đặc hiệu loài đối với N. meningitidis bao gồm các gene: ctrA và porA.
Được tiến hành trên chủng quốc tế, chủng phân lập được từ mẫu bệnh phẩm lâm sàng và từ mẫu người mang mầm bệnh, không triệu chứng.
+ Lựa chọn gene đặc hiệu cho H. influenzae: bexA
+ Lựa chọn gene đặc hiệu cho S. pneumoniae: ply và lytA.
b. Thiết kế mồi cho mPCR 2 (phát hiện nhóm A, B, C của N. meningitides)
+ Đặc hiệu với nhóm huyết thanh (serogroup) của N. meningitidis: SiaD cho nhóm(B, C) và sacD cho nhóm A, ngoài ra gen lựa chọn đích crgA trong cùng phản ứng mPCR 2 và cặp mồi này được sử dụng như chứng nội chẩn (internal control - IC) của mPCR 2.
2.3.5.2. Tối ƣu điều kiện phản ứng mPCR
Hỗn hợp mồi tối ưu và thử nghiệm mPCRs
Các bƣớc (steps) Mục đích
Kiểm tra chất lượng mồi sử dụng TOF- MS, nếu chất lượng thấp ảnh hưởng tới phản ứng khuếch đại gene.
Khuếch đại mồi riêng biệt với điều kiện phản ứng PCR.
Trên sản phẩm PCR xác định điều chỉnh nồng độ mồi.
Sơ đồ 2.4: Các bước tiến hành tối ưu phản ứng mPCR
Kiểm tra chất lượng mồi
Thử nghiệm riêng biệt từng cặp mồi với PCR đơn
Kết hợp mồi từ các vùng riêng biệt trong mPCR
Cân bằng nồng độ hỗn hợp mồi theo kinh nghiệm và sản phẩm
Đánh giá tính ổn định của qui trình kỹ thuật mPCRs bằng phương pháp thực nghiệm lặp lại trên cùng mẫu bệnh phẩm và chủng đã tuyển chọn.
Bƣớc 1: Điều kiện tối ưu cho từng cặp mồi:
- Chuẩn bị phản ứng 50µl cho một cặp mồi. + 100 - 200ng genomic DNA.
+ Nồng độ cuối cùng 0,2µM mỗi cặp. + 1X PCR đệm (buffer).
+ 1,25 - 2,5U Taq DNA polymerase.
+ Xác định chu trình nhiệt (biến tính, gắn mồi và kéo dài chuỗi).
Bƣớc 2: Tính nồng độ của các cặp mồi và tối ưu hóa điều kiện chu trình nhiệt trên
cơ sở bước 1.
Bƣớc 3: Tối ưu điều kiện mPCR (nồng độ mồi, 10X buffer, nồng độ MgCl2 và chu
kỳ nhiệt, quan trọng là Ta0C, nồng độ dNTPs, nồng độ Taq polymerase). + Nồng độ mồi: 0,1 - 0,2 µM.
+ Nhiệt độ bắt cặp dao động 10C.
+ Thời gian kéo dài trên sợi DNA khuôn mẫu là: 30 giây.
Bƣớc 4: Đọc sản phẩm:
1. Không có sản phẩm do: nồng độ mồi chưa phù hợp, nhiệt độ gắn mồi chưa chuẩn. 2. Sản phẩm có nhưng không rõ do:
+ Nồng độ mồi.
+ Đối với sản phẩm ngắn cần xem lại thời gian kéo (extension). 3. Sản phẩm đậm quá mức:
+ Giảm nồng độ mồi.
+ Đối với sản phẩm có kích thước lớn cần giảm nhiệt độ kéo dài chuỗi xuống 680C.
Có thể làm lại từ bước 1 - 3, xem xét lại các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR.
2.3.6. Đánh giá ngƣỡng phát hiện, độ nhạy và độ đặc hiệu cho phản ứng mPCRs. mPCRs.
2.3.6.1. Qui trình xác định ngƣỡng của mPCRs
A. Ngƣỡng phát hiện của mPCR 1 (N.m, Hib, S.p)
+ Lựa chọn chủng:Chủng Nm - BN Khoa, Hib - 6548d và chủng Sp - 19.
+ Tăng sinh chủng trên môi trường thạch chocolate (có VCN đối với Nm), ủ 370C/ 18 - 24 giờ. Kiểm tra độ thuần nhất của khuẩn lạc, dùng tăm bông gặt khuẩn lạc cho vào tube chứa 1 ml NMSL 0,85%. Ghi ký tự mẫu, rửa khuẩn lạc rửa 2 lần, ly tâm 2.500 rpm/5 phút, thu sinh khối.
+ Đo nồng độ vi khuẩn đạt 0,5 MacFaland (tương đương 1,5 x108 CFU/ml). + Pha loãng liên tiếp mẫu từ 108 CFU/ml theo bậc 10 (1 thể tích mẫu + 9 thể tích NMSL).
+ Tách DNA riêng từng nồng độ (theo qui trình tách DNA của CDC).
+ Thực hiện phản ứng mPCR 1 riêng cho từng mẫu. Đọc kết quả xác định nồng độ DNA ở mẫu vi khuẩn pha loãng thấp nhất còn dương tính với mPCR 1 đối với từng loại vi khuẩn.
+ Đọc kết quả trên gel thạch
B. Ngƣỡng phát hiện của mPCR 2 (nhóm A, B, C của N. meningitidis)
Tiến hành kỹ thuật:
+ Tuyển chọn chủng: Chủng N. meningitidis nhóm A (Quốc tế); chủng bệnh
N.m - nhóm B (B/N Bách phân lập từ DNT; chủng 14173).
+ Tăng sinh chủng trên môi trường thạch chocolate có VCN, ủ 370C/ 18 - 24 giờ. Kiểm tra độ thuần nhất của khuẩn lạc, dùng tăm bông gặt khuẩn lạc cho vào tube chứa 1 ml NMSL 0,85%. Ghi ký tự mẫu, rửa khuẩn lạc rửa 2 lần, ly tâm 2.500 rpm/5 phút, thu sinh khối.
+ Đo nồng độ vi khuẩn đạt 0,5 MacFaland (tương đương 1,5 x108
CFU/ml). + Pha loãng liên tiếp mẫu từ 108 VK/ml theo bậc 10 (1 thể tích mẫu + 9 thể tích NMSL 0,85%).
+ Tách DNA riêng từng nồng độ (theo qui trình tách DNA của CDC).
+ Thực hiện phản ứng mPCR 2 riêng cho từng mẫu. Đọc kết quả xác định nồng độ DNA ở mẫu vi khuẩn pha loãng thấp nhất còn dương tính với mPCR 2 đối với từng loại vi khuẩn.
+ Đọc kết quả trên gel thạch