Để kiểm tra tính an toàn của sản phẩm IL-2 chúng tôi tiến hành xác định hàm lƣợng nội độc tố trong mẫu protein IL-2 tái tổ hợp sau tinh chế bằng LAL kit. Để tăng độ tin cậy cho phép thử chúng tôi tiến hành lặp lại 3 lần và kết quả thu đƣợc thể hiện trên Hình 3.14.
Hình 3. 14: Hình ảnh kết quả sau khi dừng phản ứng đông gel
Độ nhạy của dung dịch LAL đƣợc cung cấp là 0,25 EU/ml, có nghĩa là với mẫu có nồng độ nội độc tố lớn hơn hoặc bằng 0,25 EU/ml sẽ cho kết quả dƣơng tính (tạo gel). Ở mẫu đối chứng dƣơng (nội độc tố chuẩn CSE + LAL), sau khi ủ 37ºC trong 1 giờ cho kết quả dƣơng tính, dịch trong ống eppendorf chuyển sang trạng thái gel và khi dốc ngƣợc 180º vẫn đọng lại ở đáy ống thể hiện rất rõ ràng trên Hình 3.14. Ở mẫu đối chứng âm (dH20 tại công ty VABIOTECH + LAL) và mẫu cần kiểm tra nội độc tố (sản phẩm IL-2 sau tinh chế + LAL) đều cho kết quả âm tính, saukhi dừng phản ứng toàn bộ dịch vẫn ở trạng thái lỏng và khi dốc ngƣợc 180º thì chảy hoàn toàn xuống miệng ống, chứng tỏ dịch IL-2 sau tinh chế có nồng độ nội độc tố nhỏ hơn 0,25 EU/ml. Cả 3 lần thí nghiệm đều cho kết quả nhƣ nhau cho thấy tính ổn định cũng nhƣ đảm bảo chính xác mẫu protein thu đƣợc đáp ứng tiêu chuẩn của sản phẩm tiêm là nồng độ nội độc tố không quá 0,5 EU/ml.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
Sau quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi đã hoàn thiện đƣợc quy trình sản xuất protein IL-2, đáp ứng đƣợc yêu cầu về chất lƣợng tại điều kiện phòng sản xuất đạt tiêu chuẩn GMP tại Công ty VABIOTECH.Một số kết quả cụ thể nhƣ sau:
1. ... Đ ã biểu hiện thành công protein IL-2 tái tổ hợp dạng cải biếntrong hệ thống lên men 10 lít,với điều kiện nhiệt độ là 47°C, bổ sung hai lần dinh dƣỡng (glucose 1% và cao nấm men 0,5%), cảm ứng IPTG 0,1 mM và thu mẫu sau 6 giờ cảm ứng. Hàm lƣợng protein IL-2 thu đƣợc sau quá trình lên men đạt 0,86 mg/ml. 2. ... Đ
ã tinh chế thành công sản phẩm IL-2 bằng cột bán điều chế của hệ thống sắc ký HPLC với hàm lƣợng protein IL-2 thu đƣợc sau quá trình tinh chế đạt 0,667 mg/ml.
3. ... Đ ã xác định đƣợc hoạt tính sinh học của sản phẩm IL-2 đạt 14,19 x 106
IU/mg. 4. ... Đ
ã xác định đƣợc độ sạch của sản phẩm IL-2 là 99,3% và đánh giá đƣợc hàm lƣợng nội độc tố của IL-2 nhỏ hơn 0,25 EU/ml, đáp ứng tiêu chuẩn về độ sạch và độ an toàn của sản phẩm tiêm sử dụng trong điều trị ung thƣ.
Kiến nghị
Từ những kết quả đạt đƣợc tôi xin đƣa ra một số kiến nghị sau:
1. ... X ây dựng công thức bán thành phẩm để pha chế IL-2 dạng thƣơng phẩm
2. ... K iểm tra các tiêu chí an toàn của sản phẩm IL-2 trên tế bào động vật nhƣ trên chuột và thỏ.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Anh LTL, Anh LPH, Khoa ĐT, Hong LTT, Nguyet PT, Thuy ĐT, Chien LA, & Hai TN. (2013). "Nghiên cứu tối ƣu sự biểu hiện gen mã hóa Interleukin-2 trong Escherichia coli.", pp.19–23.
2. Đặng Trần Hoàng, Đức, V. M., Phùng Thu Nguyệt, & Trƣơng Nam Hải. (2005). "Biểu hiện gen Interleukin-2 của ngƣời bị đột biến tại các điểm glycosyl hóa và gốc cystein 125 trong Escherichia coli", 3(2), pp.149–154.
3. Đỗ Thị Thảo, Đỗ Thị Phƣơng, Vũ Minh Đức, Đặng Trần Hoàng, & Trƣơng Nam Hải. (2007). "Xác định hoạt tính sinh học của interleukin-2 tái tổ hợp bằng phép thử sinh học trên tế bào CTLL2", 5(2), pp.157–161.
Tiếng Anh
4. Asgarpanah J. (2010). "Bioassay Methods useful to select the natural product cancer chemopreventive agents". Iranian Journal of Pharmaceutical Research, 0(0), pp.71– 71.
5. Bhagwat A. S., Sohail A., & Roberts R. J. (1986). "Cloning and characterization of the dcm locus of Escherichia coli K-12.". Journal of Bacteriology, 166(3), pp.751– 755.
6. Boyman O., & Sprent J. (2012). "The role of interleukin-2 during homeostasis and activation of the immune system". Nature Reviews Immunology, 12(3), pp.180– 190.
7. Caligiuri M. A., Murray C., Robertson M. J., Wang E., Cochran K., Cameron C., Schow P., Ross M. E., Klumpp T. R., & Soiffer R. J. (1993). "Selective modulation of human natural killer cells in vivo after prolonged infusion of low dose recombinant interleukin 2". The Journal of Clinical Investigation, 91(1), pp.123– 132.
8. Chu M. B., Fesler M. J., Armbrecht E. S., Fosko S. W., Hsueh E., Richart J. M., Chu M. B., Fesler M. J., Armbrecht E. S., Fosko S. W., Hsueh E., & Richart J. M. (2013). "High-Dose Interleukin-2 (HD IL-2) Therapy Should Be Considered for
Treatment of Patients with Melanoma Brain Metastases, High-Dose Interleukin-2 (HD IL-2) Therapy Should Be Considered for Treatment of Patients with Melanoma Brain Metastases". Chemotherapy Research and Practice, Chemotherapy Research and Practice, 2013, 2013, pp.e726925.
9. Cockshott A. R., & Bogle I. D. L. (1999). "Modelling the effects of glucose feeding on a recombinant E. coli fermentation". Bioprocess Engineering, 20(1), pp.83–90. 10. Devos R., Plaetinck G., Cheroutre H., Simons G., Degrave W., Tavernier J.,
Remaut E., & Fiers W. (1983). "Molecular cloning of human interleukin 2 cDNA and its expression in E. coli". Nucleic Acids Research, 11(13), pp.4307–4323. 11. Eckenberg, R., Moreau, J.L., Melnyk, O., & Thèze, J. (2000). "IL-2R beta agonist
P1-30 acts in synergy with IL-2, IL-4, IL-9, and IL-15: biological and molecular effects.", 1950(165), pp.4312–4318.
12. Eton O., Rosenblum M. G., Legha S. S., Zhang W., Jo East M., Bedikian A., Papadopoulos N., Buzaid A., & Benjamin R. S. (2002). "Phase I trial of subcutaneous recombinant human interleukin-2 in patients with metastatic melanoma". Cancer, 95(1), pp.127–134.
13. Ferlay J., Soerjomataram I., Dikshit R., Eser S., Mathers C., Rebelo M., Parkin D. M., Forman D., & Bray F. (2013). "Cancer incidence and mortality worldwide: Sources, methods and major patterns in GLOBOCAN 2012: Globocan 2012". International Journal of Cancer, 136(5), pp.E359–E386.
14. Ferlay, J., Shin, H.-R., Bray F, Forman, D., Mathers, C., & Parkin, D.M. (2010). "Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008", 127, pp.2893–2917.
15. Francis D. M., & Page R. (2010). "Strategies to optimize protein expression in E. coli". Current Protocols in Protein Science / Editorial Board, John E. Coligan ... [et Al.], Chapter 5, pp.Unit 5.24.1–29.
16. Gaffen S. L., & Liu K. D. (2004). "Overview of interleukin-2 function, production and clinical applications". Cytokine, 28(3), pp.109–123.
17. Grodberg J., & Dunn J. J. (1988). "ompT encodes the Escherichia coli outer membrane protease that cleaves T7 RNA polymerase during purification". Journal of Bacteriology, 170(3), pp.1245–1253.
18. Haacke A., Fendrich G., Ramage P., & Geiser M. (2009). "Chaperone over- expression in Escherichia coli: apparent increased yields of soluble recombinant protein kinases are due mainly to soluble aggregates". Protein Expression and Purification, 64(2), pp.185–193.
19. Hammerling U., Henningsson A. C., & Sjödin L. (1992). "Development and validation of a bioassay for interleukin-2". Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 10(8), pp.547–553.
20. Janice P. Dutcher. (2002, November 1). "Current Status of Interleukin-2 Therapy for Metastatic Renal Cell Carcinoma and Metastatic Melanoma: Page 2 of 2 | Cancer Network".
21. Ju G., Collins L., Kaffka K. L., Tsien W. H., Chizzonite R., Crowl R., Bhatt R., & Kilian P. L. (1987). "Structure-function analysis of human interleukin-2. Identification of amino acid residues required for biological activity". The Journal of Biological Chemistry, 262(12), pp.5723–5731.
22. Keilholz U., Conradt C., Legha S. S., Khayat D., Scheibenbogen C., Thatcher N., Goey S. H., Gore M., Dorval T., Hancock B., Punt C. J., Dummer R., Avril M. F., Bröcker E. B., Benhammouda A., Eggermont A. M., & Pritsch M. (1998). "Results of interleukin-2-based treatment in advanced melanoma: a case record-based analysis of 631 patients". Journal of Clinical Oncology: Official Journal of the American Society of Clinical Oncology, 16(9), pp.2921–2929.
23. Kush Sachdeva, Brendan Curti, & Bagi RP Jana. (2015). "Renal Cell Carcinoma: Practice Essentials, Background, Pathophysiology".
24. Liang S. M., Thatcher D. R., Liang C. M., & Allet B. (1986). "Studies of structure- activity relationships of human interleukin-2". The Journal of Biological Chemistry, 261(1), pp.334–337.
25. Losen M., Frölich B., Pohl M., & Büchs J. (2004). "Effect of oxygen limitation and medium composition on Escherichia coli fermentation in shake-flask cultures". Biotechnology Progress, 20(4), pp.1062–1068.
26. MacWilliams M. P., & Bickle T. A. (1996). "Generation of new DNA binding specificity by truncation of the type IC EcoDXXI hsdS gene.". The EMBO Journal, 15(17), pp.4775–4783.
27. Moffatt BA, Dunn JJ, & Studier FW. (1984). "Nucleotide sequence of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase", 173(2), pp.265–269.
28. Monod J. (1949). "The Growth of Bacterial Cultures". Annual Review of Microbiology, 3(1), pp.371–394.
29. Morgan D. A., Ruscetti F. W., & Gallo R. (1976). "Selective in vitro growth of T lymphocytes from normal human bone marrows". Science (New York, N.Y.), 193(4257), pp.1007–1008.
30. Oona Mcpolin. (2009). "Preview - An Introduction to HPLC for Pharmaceutical Analysis - Preview_book_introduction_HPLC.pdf".
31. Peter Boyle B. L. (2008). World Cancer Report.
32. R J Robb R. M. K. (1984). "Amino acid sequence and post-translational modification of human interleukin 2". Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 81(20), pp.6486–90.
33. Roche S. (2010, December). Interleukin-2, human (hIL-2) recombinant (E. coli). 34. Rosenberg S. A., Yang J. C., Topalian S. L., Schwartzentruber D. J., Weber J. S.,
Parkinson D. R., Seipp C. A., Einhorn J. H., & White D. E. (1994). "Treatment of 283 consecutive patients with metastatic melanoma or renal cell cancer using high- dose bolus interleukin 2". JAMA, 271(12), pp.907–913.
35. Safar M., & Junghans R. P. (2000). "Interleukin 2 maintains biologic stability and sterility over prolonged time". Immunopharmacology, 49(3), pp.419–423.
36. Schnaitman C. A., & Austin E. A. (1990). "Efficient incorporation of galactose into lipopolysaccharide by Escherichia coli K-12 strains with polar galE mutations.". Journal of Bacteriology, 172(9), pp.5511–5513.
37. Sim M., Seok H.-S., & Kim J. (2013). "A Next-generation Sequence Clustering Method for E. Coli through Proteomics-genomics Data Mapping". Procedia Computer Science, 23, pp.96–101.
38. Swinehart D. F. (1962). "The Beer-Lambert Law". Journal of Chemical Education, 39(7), pp.333.
39. Taniguchi T., Matsui H., Fujita T., Takaoka C., Kashima N., Yoshimoto R., & Hamuro J. (1992). "Structure and expression of a cloned cDNA for human interleukin-2. 1983". Biotechnology (Reading, Mass.), 24, pp.304–309.
40. Tincati C., d’Arminio Monforte A., & Marchetti G. (2009). "Immunological mechanisms of interleukin-2 (IL-2) treatment in HIV/AIDS disease". Current Molecular Pharmacology, 2(1), pp.40–45.
41. Titov K. S., Kiselevskii M. V., Demidov L. V., Mikhailova I. N., Shubina I. Z., Rodionova L. M., Sinel’nikov I. E., Topol’ K. Y., & Gritsai A. N. (2009). "Use of recombinant interleukin-2 for intrapleural therapy of tumor-associated pleurisy". Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 148(5), pp.794–796.
42. Ulrik Mouritzen, Christiance Voit. (2012). "Neoadjuvant treatment of cancer with proleukin".
43. WHO. (2004, May 28). 1st Standard for INTERLEUKIN 2 (Human, Jurkat derived) NIBSC code: 86/504.
44. William Bowers. (2001). "CELL-MEDIATED IMMUNITY: Cell interactions in specific immune responses".
45. Yin J., Li G., Ren X., & Herrler G. (2007). "Select what you need: a comparative evaluation of the advantages and limitations of frequently used expression systems for foreign genes". Journal of Biotechnology, 127(3), pp.335–347.
46. DrugBank (Ed.). (2013). "Aldesleukin". In DrugBank.
47. "Renal Cell Cancer Treatment". (2015). National Cancer Institute. 48. "Melanoma Treatment". (2015). National Cancer Institute.
49. "World Health Organization, World Cancer Report 2014". (2014). SEARO. 50. "Melanoma - Cancer Council Australia". (2015).
Internet 52. http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/ 53. http://www.cancer.gov/about-cancer/what-is-cancer 54. http://www.cancerresearch.org/cancer-immunotherapy/ 55. http://vietbao.vn/Suc-khoe/Canh-giac-voi-benh-ung-thu-than/40127601/248/ 56. http://www.newhealthadvisor.com/Renal-Cell-Carcinoma-Staging.html 57. http://www.melanomacenter.org/basics/statistics.html 58. http://www.atcc.org/products/all/TIB-214.aspx 59. http://www.ispe.org/gmp-resources/what-is-gmp 60. http://www.isovietnam.com.vn/tu-van-quan-ly-doanh-nghiep/dao-tao-tu-van-gdp- gpp/95-tieu-chuan-gmp-glp-gsp-gdp-gpp.html 61. http://vesinhantoanthucpham.com.vn/lich-su-hinh-thanh-san-xuat-tot-gmp 62. http://www.vinmec.com/tin-tuc-hoat-dong/so-luoc-tong-quan-tinh-hinh-ung-thu- tai-viet-nam-a404.html 63.http://www.nihbt.org.vn/tin-trong-nuoc/sung-sot-vi-benh-nhan-ung-thu-tang- nhanh/p124i6718.html 64.http://www.nhandan.com.vn/mobile/_mobile_suckhoe/_mobile_tintucsk/item/2820 1702.html 65.http://info.ebioscience.com/bid/78957/What-does-ED50-Mean 66. http://www.cancer.gov/types/skin/hp/skin-genetics-pdq 67. http://sbc-vietnam.com/Tin-tuc/YEAST-EXTRACT-MUA-O-%C4%90AU.aspx
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌCLIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN
1. Le Phuong Hoang Anh, Dao Trong Khoa, Nguyen Thi Minh Thu, Phung Thu Nguyet, Phan Thi Thanh Huyen, Truong Nam Hai (2015). Purification of recombinant human interleukin-2. National Conference Vietnam Association of Biochemistry. 74.
2. Lê Phƣơng Hoàng Anh, Nguyễn Thị Minh Thu, Đào Trọng Khoa, Phùng Thu Nguyệt, Trần Ngọc Tân, Lƣu Anh Chiến, Đoàn Thị Thủy, Trƣơng Nam Hải (2015). Tinh chế và xác định hoạt tính sinh học của interleukin-2 ngƣời tái tổ hợp dạng cải biến. Hội nghị khoa học kỷ niệm 40 năm (1975-2015) thành lập Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam. 13.
3. Nguyễn Thị Minh Thu, Lê Phƣơng Hoàng Anh, Đào Trọng Khoa, Trần Ngọc Tân, Nguyễn Minh Nga, Lƣu Anh Chiến, Đoàn Thị Thủy, Phùng Thu Nguyệt, Trƣơng Nam Hải (2015). Nghiên cứu tổng hợp interleukin-2 ngƣời tái tổ hợp trong hệ thống lên men 10 (lít) theo tiêu chuẩn GMP. Tạp chí Công nghệ Sinh học 13(3): 1-10.
PHỤ LỤC
1. ... P hụ lục I.Trình tự vector pET22b(+) mang gen il-2 cải biến loại alanine ở đầu N (ký hiệu pET22_IL-2_desAla)
2. ... P hụ lục II.Hƣớng dẫn thực hành tốt sản xuất sinh phẩm