Để chuyển giao quy trình sản xuất IL-2 tái tổ hợp sang công ty VABIOTECH, chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm lên men chủng E. coli BL21-IL2 trong hệ thống lên men 10 lít tại phòng sản xuất đạt tiêu chuẩn GMP. Trƣớc tiên các điều kiện lên men tại VABIOTECH đƣợc tiến hành theo các điều kiện đã tối ƣu trên hệ thống lên men 5 lít tại Viện Công nghệ sinh học. Tế bào đƣợc biểu hiện ở điều kiện nhiệt độ
nhiệt độ 47ºC và cảm ứng với IPTG nồng độ cuối cùng 0,5 mM, quá trình sinh tổng hợp IL-2 đƣợc kết thúc sau ba giờ cảm ứng IPTG . Tuy nhiên, trong quá trình biểu hiê ̣n protein, khi cảm ƣ́ng IPTG ở mật độ tế bào thấp giá trị OD 600 cảm ứng từ 0,4 đến 0,8 thì toàn bộ tế bào tập trung vào sinh tổng hợp protein và khả năng sinh trƣởng của tế bào cũng bị ảnh hƣởng. Bên cạnh đó, theo Current Protocols in Protein Science cho thấy trong quá trình lên men quy mô lớn thời điểm cảm ứng thích hợp là khi OD600 đạt từ 15 đến 20. Vì vậy, trong đợt lên men này chúng tôi tiến hành cảm ứng IPTG tại thời điểm OD600 đạt từ 15 đến 20 thay vì cảm ứng tại thời điểm OD600 từ 0,4 đến 0,8 nhƣ ở hệ thống lên men 5 lít tại Viện Công nghệ sinh học. Thành phần dinh dƣỡng bao gồm 1% glucose + 0,5% cao nấm men đƣợc đƣợc bổ sung vào quá trình lên men khi giá trị dOT giảm xuống dƣới 20%.Quá trình sinh trƣởng của chủng E. coli BL21-IL2 trong hệ thống lên men 10 lít đợt 1 đƣợc thể hiện trên Hình 3.3.
Hình 3. 3: Đƣờng cong sinh trƣởng của chủng tái tổ hợp E. coli BL21-IL2 đợt 1 Đƣờng cong sinh trƣởng của chủng E. coli BL21-IL2 trên Hình 3.3 cho thấy chủng sinh tổng hợp IL2 tiếp tục sinh trƣởng mạnh sau khi bổ sung dinh dƣỡng ở thời điểm 2 và 4 giờ sau khi lên men. ITPG đƣợc bổ sung ở thời điểm khi OD đạt
hơn 20 sau 5 giờ nuôi cấy, tuy nhiên sau khi bổ sung chất cảm ứng tốc độ sinh trƣờng chủng E. coli BL21-IL2 bị giảm xuống đột ngột chứng tỏ việc bổ sung IPTG nồng độ cao (0,5 mM) vào môi trƣờng nuôi cấy có mật độ tế bào cao cũng làm giảm sự sinh trƣởng của tế bào do nồng độ IPTG cao có thể gây độc cho tế bào, dẫn đến ức chế sinh trƣởng của vi khuẩn. Vì vậy để duy trì sự sinh trƣởng của chủng, chất dinh dƣỡng tiếp tục đƣợc bổ sung lần ba tại thời điểm sau 6 giờ lên men. Sau khi bổ sung nguồn chất dinh dƣỡng lần thứ ba, tế bào tiếp tục sinh trƣởng và quá trình lên men đƣợc kết thúc sau 3 giờ cảm ứng khi OD600 đạt 18,3. Nhƣ vậy, khi dOT giảm xuống tại thời điểm 2 và 4 giờ chứng tỏ nguồn dinh dƣỡng bị cạn kiệt, gây ra sự suy giảm khả năng sinh trƣởng của tế bào. Khi bổ sung các thành phần glucose và cao nấm men thì sự sinh trƣởng của vi khuẩn lại đƣợc phục hồi. Bên cạnh đó, khi cảm ứng ở thời điểm OD600 đạt từ 15 đến 20 cho kết quả mật độ tế bào ở thời điểm thu mẫu cao gấp 3 lần so với cảm ứng ở thời điểm OD600 đạt từ 0,4 đến 0,8 ở hệ thống lên men 5 lít tại Viện Công nghệ sinh học. Điều này có thể đƣợc lý giải là do khi thay đổi 2 hệ thống lên men khác nhau và điều kiện tại phòng thí nghiệm tại Viện Công nghệ sinh học khác phòng sản xuất đạt tiêu chuẩn GMP, đặc biệt thời điểm giá trị OD600 cảm ứng cũng ảnh hƣởng đến quá trình sinh trƣởng của tế bào. Điện di kiểm tra sự biểu hiện protein IL-2 tái tổ hợp sau 1, 2, 3 giờ cảm ứng trên gel polyacrylamide 12,6% (Hình 3.4).
Hình 3. 4: Điện di Protein tổng số khi biểu hiện chủng E. coli BL21-IL2 trong hệ thống lên men 10 lít đợt 1
M: Thang protein chuẩn; Đƣờng chạy 1, 2, 3: Protein tổng số sau 1, 2, 3 giờ cảm ứng IPTG; Đƣờng chạy 4: Protein tổng số biểu hiện trong bình tam giác. Kết quả trên Hình 3.4 cho thấy sự biểu hiện IL-2 ở cùng thời điểm sau 3 giờ cảm ứng (thời điểm thu mẫu) thì kết quả cho thấy IL-2 tổng hợp trong hệ thống lên men 10 lít (đƣờng chạy 3) đạt khoảng 0,21 mg/mlkém hơn 3 lần so với lên men trong bình tam giác (đƣờng chạy 4) mặc dù OD600 tại thời điểm thu mẫu trong hệ thống lên men 10 lít cao hơn gấp khoảng hơn 9 lần (OD600 đạt khoảng 18) so với lên men trong bình tam giác (OD600 đạt khoảng 2). Điều kiện lên men trong bình tam giác không có sự bổ sung các chất dinh dƣỡng trong quá trình sinh trƣởng của chủng tái tổ hợp nhƣng protein IL-2 lại đƣợc tổng hợp mạnh hơn so với hệ thống lên men 10 lít. Điều này chứng tỏ việc bổ sung cơ chất nhiều lần có thể làm tăng sinh khối tế bào nhƣng ảnh hƣởng đến quá trình sinh tổng hợp protein do tế bào tập trung vào quá trình sinh trƣởng hơn là tập trung vào sự biểu hiện của protein. Vì vậy, để tối ƣu quá trình biểu hiện IL-2 trong hệ thống lên men 10 lít đạt tiêu chuẩn GMP, chúng tôi tiến hành lên men đợt 2 với sự thay đổi một số thông số trong quá trình lên men.