Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography, HPLC), ra đời năm 1967-1968 trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phƣơng pháp sắc ký cột cổ điển. HPLC là một phƣơng pháp phân tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột là chất rắn đã đƣợc phân chia dƣới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã đƣợc cải biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ [30]. HPLC là một phƣơng pháp tách và phân tích các hợp chất đƣợc sử dụng rộng rãi và phổ biến nhất hiện nay vì nhiều lí do nhƣ: (i) độ nhạy cao, (ii) khả năng định lƣợng tốt, (iii) thích hợp cho việc tách các hợp chất khó bay hơi hoặc dễ bị phân hủy nhiệt, (iv)
phạm vi ứng dụng trải rộng trong nhiều lĩnh vực từ nghiên cứu khoa học trong các phòng thí nghiệm đến công nghiệp và một số lĩnh vực khác.
Hình 1. 10: Hệ thống tinh sạch protein HPLC
Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, ngƣời ta chia HPLC thành nhiều loại. Trong đó, sắc ký phân bố đƣợc ứng dụng nhiều nhất nhờ vào ƣu điểm có thể phân tích hợp chất ion có khối lƣợng phân tử không quá lớn và có phổ phân cực rộng (từ hợp chất không phân cực đến những hợp chất phân cực rất cao). Sắc ký phân bố đƣợc chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tƣơng đối giữa pha tĩnh và pha động: sắc ký pha thƣờng (normal phase chromatography) và sắc ký pha đảo (reversed phase chromatography). Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tƣơng ứng với tính chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan,…). Trong hệ thống sắc ký chỉ có các phân tử pha động mới chuyển động dọc theo hệ sắc ký. Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá trình chuyển động dọc theo hệ sắc ký hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ, phản hấp phụ. Hệ quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc ký so với các chất tƣơng tác yếu hơn pha này. Nhờ đặc điểm này mà ngƣời ta có thể tách các chất qua quá trình sắc ký [30].
Trong sắc ký pha thƣờng, pha tĩnh sử dụng có độ phân cực cao hơn pha động. Pha tĩnh loại này sẽ có ái lực với các hợp chất phân cực. Sắc ký pha thƣờng dùng để tách và phân tích các hợp chất có độ phân cực cao với phân tử lƣợng không quá lớn.
Sắc ký pha đảo là thuật ngữ để chỉ một loại sắc ký trong đó pha tĩnh ít phân cực hơn pha động. Phƣơng pháp này dùng để phân tách các hợp chất từ không phân cực đến phân cực. Hầu hết các hợp chất hữu cơ có mạch carbon dài (ít phân cực) rất thích hợp cho phân tích bằng sắc ký pha đảo. Dung môi sử dụng trong sắc ký pha đảo là các dung môi phân cực, trong đó dung môi nƣớc đóng vai trò quan trọng và giá thành rẻ. Do đó, sắc ký pha đảo đƣợc ứng dụng nhiều và phổ biến hơn sắc ký pha thƣờng. Nguyên lý của sắc ký pha đảo là protein sẽ gắn vào pha tĩnh theo tƣơng tác kỵ nƣớc ở các mức độ khác nhau, khi thực hiện tách rửa, gradient nồng độ isopropanol đƣợc sử dụng tăng dần và gradient nồng độ nƣớc giảm dần dẫn đến sự tăng dần của tính kỵ nƣớc trong pha động, các protein bám trong pha tĩnh lần lƣợt đƣợc loại ra ngoài.