Nguyên lý
Western blotting là phƣơng pháp đƣợc sử dụng để nhận diện một kháng nguyên đặc hiệu nhờ các kháng thể đơn dòng hoặc đa dòng tƣơng ứng. Protein nằm trên gel SDS-PAGE đƣợc chuyển sang màng hấp thụ - Polyvinylidene diflouride (PVDF), sau đó protein đƣợc xác định bằng phản ứng giữa kháng thể 1 (kháng thể chuột kháng với Interleukin-2 ngƣời - hãng sigma) và kháng thể 2 (kháng với kháng thể 1-hãng sigma) có gắn với chất chỉ thị màu.
Quy trình
Mẫu protein đƣợc chạy điện di biến tính bằng SDS-PAGE với các vị trí tƣơng ứng, khi gỡ gel điện di thì đặt vào trong dung dịch blotting 1x để lạnh, tránh gel bị khô.
Màng PVDF đƣợc ngâm trong methanol 100% trong 5 phút trƣớc khi chuyển sang dung dịch blotting. Hộp chuyển màng, xốp, giấy thấm và màng PVDF đƣợc đặt vào khay đựng blotting 1x lạnh. Màng và gel đƣợc đặt vào hộp chuyển theo thứ tự mặt đen của hộp chuyển (cực âm), xốp, giấy thấm, gel, màng PVDF, giấy thấm, xốp, mặt trắng của hộp chuyển (cực dƣơng). Lắp hộp vào bộ chuyển màng, đổ dung dịch blotting 1x vào ngập bộ chuyển màng, thêm đá vụn vào bộ chuyển màng cho nhiệt độ không lên quá cao. Sau đó chạy với hiệu điện thế 100V trong 2 giờ ở 4ºC, khuấy từ nhẹ.
Màng PVDF sau khi thực hiện quá trình chuyển màng đƣợc phủ bằng dung dịch sữa skim milk 5% trong dung dịch TBS, ở 4ºC qua đêm. Rửa màng bằng dung dịch TTBS, 3 lần mỗi lần 10 phút rồi rửa tiếp bằng dung dịch TBS, 3 lần mỗi lần 5 phút. Phủ kháng thể 1 (kháng thể đơn dòng kháng đặc hiệu IL-2) pha loãng về nồng độ cuối cùng khoảng 0,2-0,4 μg/ml trong sữa skim milk 5% (pha trong TBS), lắc ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ.
Màng PVDF đƣợc rửa bằng dung dịch TTBS và TBS lặp lại nhƣ trên trƣớc khi phủ kháng thể 2 (cộng gộp kháng thể Ig G- kháng thể chuột gắn peroxidase ) pha
5% pha trong TBS, lắc ở nhiệt độ phòng trong 2 giờ. Sau khi phủ kháng thể 2, màng PVDF đƣợc rửa bằng TTBS và TBS nhƣ trên trƣớc khi hiện mẫu trong dung dịch hiện màu của BioRad. Màng đƣợc lắc nhẹ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút và quan sát.