Nguyên lý
Dựa vào đặc tính của dòng tế bào CTLL2 là tế bào sinh trƣởng phụ thuộc hoàn toàn vào IL-2, khi môi trƣờng nuôi cấy dòng tế bào CTLL2 không đƣợc bổ sung IL- 2 thì tế bào sẽ chết trong khoảng 24-48 giờ. Khi bổ sung IL-2 vào môi trƣờng nuôi cấy dòng tế bào CTLL2 thì tùy thuộc vào hoạt tính của IL-2 mà tế bào CTLL2 sẽ duy trì sự sống và đƣợc kích hoạt để phát triển và sinh sản. Hoạt tính của IL-2 càng mạnh thì khả năng tăng sinh của tế bào CTLL2 càng cao. Sự hoạt động của IL-2 đƣợc xác định bằng cách đo tổng số thimidine từ ADN tổng hợp của các tế bào CTLL2 tăng sinh.
Phƣơng pháp hoạt hóa và duy trì tế bào CTLL-2
Chuẩn bị sẵn ống ly tâm có chứa 10 ml môi trƣờng nuôi cấy RPMI-1640 đầy đủ có bổ sung 10% FBS. Sau đó, lấy ống tế bào giữ chủng tế bào CTLL2 từ trong nitơ lỏng và đƣa ngay vào nƣớc ấm 37°C. Khi dung dịch bên trong ống đã tan đá
hoàn toàn, chuyển ngay dung dịch bên trong ống giữ chủng sang ống ly tâm đã chuẩn bị sẵn môi trƣờng nuôi cấy (bƣớc này để pha loãng nồng độ DMSO (Dimethyl Sulfoxide) giúp giảm sự gây độc của nó đối với tế bào ở nhiêt độ thƣờng), ly tâm với tốc độ 1000 vòng/phút trong 5 phút. Sau đó hút bỏ dịch nổi để loại DMSO có trong ống giữ chủng. Tiếp theo hòa cặn tế bào bằng môi trƣờng nuôi cấy là RPMI-1640đầy đủ có bổ sung 10% FBS, hút và chuyển từ từ dung dịch tế bào sang chai nuôi cấy thích hợp, bổ sung IL-2. Cuối cùng để chai nuôi vào ủ trong tủ 37°C, CO2 5% có độ ẩm. Sau 3-5 ngày thì cấy chuyển nhằm duy trì tế bào. Tế bào đƣợc sử dụng để làm phép xác định hoạt tính sau ít nhất 2 ngày kể từ khi cấy chuyển.
Phƣơng pháp MTT assay
Hòa loãng mẫu IL-2 tái tổ hợp và mẫu IL-2 chuẩn (USA hoặc China) trong 50 µl môi trƣờng RPMI-1640đầy đủ có bổ sung 10% FBS vào các giếng đầu tiên trong đĩa microtiter 96 giếng, mỗi một mẫu đƣợc lặp lại 3 lần. Các giếng đối chứng âm chỉ có tế bào và môi trƣờng nuôi cấy, không có IL-2. Sau tối thiểu 2 ngày nuôi cấy, khi tế bào ở pha log thì tiến hành thu tế bào CTLL-2 và rửa bằng môi trƣờng RPMI- 1640đầy đủ để loại bỏ IL-2 còn dƣ thừa trong quá trình nuôi cấy tế bào, tránh ảnh hƣởng đến quá trình làm phép xác định hoạt tính. Hòa cặn tế bào thu đƣợc sau khi ly tâm để đạt mật độ 106 tế bào/ml và nhỏ mỗi giếng thí nghiệm 50 µl. Đĩa thí nghiệm đƣợc ủ trong tủ 37°C, 5% CO2 có độ ẩm. Sau 24 giờ nuôi, bổ sung 10 µl MTT (5 mg/ml pha trong PBS) vào từng giếng (chứa 100 µl tế bào), ủ tế bào 4 giờ trong tủ nuôi 37°C, CO2 5% có độ ẩm. Sau 4 giờ ủ với MTT lấy đĩa nuôi cấy bổ sung 100 µl isopropanol HCl 0,04N vào mỗi giếng, mix bằng pipet mạnh nhiều lần để hòa tan các tinh thể mầu xanh đậm, để đĩa ở trạng thái tĩnh khoảng 3 – 5 phút. Đọc kết quả bằng bƣớc sóng 595 nm.
Phân tích kết quả
Sau khi có kết quả đo mật độ quang học (OD), phần mềm Graphpad Prism 5.0 đƣợc sử dụng để tính giá trị EC50 (half maximal effective concentration, EC50: là nồng độ mà tại đó các protein thể hiện 50% hoạt tính tối đa (bão hòa)), mẫu thí nghiệm nào có giá trị EC50 càng thấp thì mẫu đó có hoạt tính càng cao. Sau đó
chúng tôi tiến hành quy đổi và xác định hoạt tính sinh học riêng của IL-2 theo quy chuẩn quốc tế.
+ Hoạt tính sinh học riêng (Units/mg) [65]: A(U/mg)= 106 / EC50
+ Hoạt tính sinh học riêng theo chuẩn quốc tế (International Units/mg)[33][43]: A (IU/mg) = A(U/mg) x