Quá trình sinh trƣởng của vi khuẩn nói chung và chủng E. coli nói riêng chịu ảnh hƣởng của nhiều yếu tố nhƣ nhiệt độ, pH môi trƣờng, oxy hòa tan, nồng độ chất cảm ứng, và thành phần dinh dƣỡng bổ sung [28]. Đối với chủng vi khuẩn sản xuất protein tái tổ hợp thì thành phần chất dinh dƣỡng, nồng độ chất cảm ứng và thời điểm bổ sung chất cảm ứng để biểu hiện protein cũng là một trong các yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến khả năng sinh trƣởng của chủng. Trong những nghiên cứu trƣớc đây, chúng tôi đã tối ƣu đƣợc điều kiện biểu hiện của chủng E. coli BL21 IL-2 ở quy mô bình tam giác [1], tuy nhiên điều kiện biểu hiện protein ở quy mô nhỏ có sự khác biệt với quá trình lên men trong các hệ thống lên men. Vì vậy, để nâng cao quá trình sinh tổng hợp IL-2 ở hệ thống lên men 5 lít, chúng tôi tiến hành khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men nhƣ thành phần chất dinh dƣỡng bổ sung và nồng độ chất cảm ứng trong điều kiện lên men này.
Một số thành phần dinh dƣỡng nhƣ glucose, glycerol, cao nấm men hoặc chất cảm ứng IPTG có vai trò quan trọng trong sự tổng hợp của protein tái tổ hợp. Cao nấm men là nội bào của tế bào nấm men, bao gồm tế bào chất, nhân tế bào và các cơ quan tế bào và thƣờng rất giàu amino acid, vitamin (vitamin B, Glutathione), cacbon hydrat và muối [67]. Cao nấm men đƣợc sử dụng rất phổ biến nhƣ một
nguồn nitrogene phong phú, glucose và glycerol cũng đƣợc sử dụng nhƣ những nguồn carbon và nguồn năng lƣợng thiết yếu bổ sung trong quá trình nuôi cấy vi khuẩn nói chung và E. coli nói riêng, đặc biệt là glucose, thành phần quan trọng trong con đƣờng chuyển hóa cơ bản của tế bào [9].
Trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành lên men ở điểu kiện 47ºC và bổ sung hỗn hợp dinh dƣỡng bao gồm 1% glucose kết hợp với 0,5% cao nấm men hoặc 1% glycerol kết hợp với 0,5% cao nấm men tại thời điểm khi nguồn dinh dƣỡng trong hệ thống lên men giảm (dOT giảm xuống dƣới 20%). Việc sử dụng kết hợp các nguồn cacbon khác nhau với mục đích làm tăng quá trình sinh trƣởng của tế bào. Bên cạnh đó để tối ƣu điều kiện tổng hợp IL-2, chất cảm ứng IPTG ở nồng độ 0,5 mM và 1 mM đƣợc bổ sung trong quá trình nuôi cấy. Quá trình bổ sung IPTG đƣợc tiến hành một hoặc hai lần, cảm ứng lần một ở thời điểm giá trị OD600 đạt khoảng từ 0,4 đến 0,8; sau 1 giờ tiến hành cảm ứng lần hai nhằm tăng khả năng sinh tổng hợp protein IL-2. Các mẫu đƣợc thu sau 3 giờ cảm ứng. Kết quả khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men đƣợc thể hiện trên Bảng 3.1.
Bảng 3. 1: Giá trị OD mẫu thu đƣợc sau quá trình lên men
Mẫu Thành phần bổ sung Điều kiện cảm ứng IPTG Giá trị OD600 Hàm lƣợng IL-2 (mg/ml) Mẫu 1 1% glucose + 0,5% cao nấm men Cảm ứng 01 lần 1 mM IPTG 3,91 0,487 Mẫu 2 1% glycerol + 0,5% cao nấm men Cảm ứng 01 lần 1 mM IPTG 3,97 0,342 Mẫu 3 1% glucose + 0,5% cao nấm men Cảm ứng 01 lần 0,5 mM IPTG 6,26 0,523 Mẫu 4 1% glycerol + 0,5% cao nấm men Cảm ứng 01 lần 0,5 mM IPTG 6,56 0,351 Mẫu 5 1% glucose + 0,5% cao nấm men Cảm ứng 02 lần 0,5 mM IPTG 5,84 0,452
cao nấm men 0,5 mM IPTG Đối chứng (-) Không bổ sung chất dinh dƣỡng Cảm ứng 01 lần 1 mM IPTG 1,35 0,174
Kết quả trên Bảng3.1 cho thấy sau khi dừng quá trình lên men, tất cả các mẫu lên men đƣợc bổ sung chất dinh dƣỡng đều có giá trị OD600 thu mẫu cao hơn từ 3 - 5 lần và hàm lƣợng IL-2 thu đƣợc cao gấp 2-3 lần so với mẫu đối chứng âm khi không đƣợc bổ sung chất dinh dƣỡng. Việc bổ sung glycerol hay glucose kết hợp với cao nấm men đều làm tăng sinh khối tế bào và tăng hàm lƣợng IL-2 đƣợc tổng hợp, điều này chứng tỏ các nguồn carbon này đều thích hợp bổ sung vào quá trình nuôi cấy chủng E. coli BL21-IL2. Giá trị OD600 khi thu mẫu ở mẫu 3 và mẫu 4 đạt cao nhất (khoảng 6,26 và 6,56), tuy nhiên hàm lƣợng IL-2 đƣợc tổng hợp ở hai mẫu này lại tƣơng đối khác nhau (đạt khoảng 0,523 và 0,351 mg/ml). Điều này chứng tỏ mặc dù sinh khối tế bào tăng nhƣng quá trình tổng hợp protein khi bổ sung với hai nguồn cơ chất glycerol và glucose là khác nhau. Khi so sánh hàm lƣợng IL-2 đƣợc tổng hợp ở các mẫu cho thấy với các mẫu có bổ sung glucose/cao nấm men (mẫu 1, 3, 5) thì IL-2 đƣợc tổng hợp đều cao hơn so với các mẫu có bổ sung glycerol/cao nấm men (mẫu 2, 4, 6). Kết quả này cho thấy nguồn dinh dƣỡng glucose thích hợp hơn so với nguồn cơ chất glycerol khi bổ sung vào quá trình lên men. Ngoài ra, việc cảm ứng với IPTG ở nồng độ 0,5 mM thì hàm lƣợng IL-2 vẫn đạt tƣơng đƣơng nhƣ khi cảm ứng với IPTG 1 mM. Vì vậy để giảm thiểu chi phí sản xuất khi sử dụng chất cảm ứng IPTG, chúng tôi lựa chọn nồng độ cảm ứng cho quá trình lên men tổng hợp IL-2 là 0,5 mM IPTG. Từ các kết quả trên chúng tôi lựa chọn điều kiện bổ sung chất dinh dƣỡng là 1% glucose kết hợp 0,5% cao nấm men và 0,5 mM IPTG cho quá trình lên men tiếp theo. Tế bào sau khi lên men đƣợc thu lại và kiểm tra điện di trên gel SDS-PAGE 12,6%. Kết quả điện di đƣợc thể hiện trên Hình 3.2.
Hình 3. 2: Khảo sát bổ sung thành phần chất dinh dƣỡng và nồng độ IPTG trong quá trình lên men
M: Thang protein chuẩn;(+): Đối chứng dƣơng (IL-2 chuẩn); (-): Đối chứng âm (không bổ sung chất dinh dƣỡng); Đƣờng chạy 1 – 6: Mẫu lên men 1-6. Kết quả điện di trên Hình 3.2 cho thấy, ở tất cả các đƣờng chạy (từ 1 đến 6) đều xuất hiện băng protein có kích thƣớc khoảng 15 kDa, đúng theo kích thƣớc của IL-2 theo lý thuyết và của đối chứng dƣơng (IL-2 chuẩn). Các băng protein IL-2 ở các mẫu có bổ sung dinh dƣỡng đều đậm nét hơn so với mẫu không đƣợc bổ sung dinh dƣỡng (đối chứng âm). Protein IL-2 đƣợc biểu hiện đậm nhất ở đƣờng chạy số 3, kết quả này hoàn toàn phù hợp với kết quả đo hàm lƣợng protein IL-2 trên Bảng 3.1 khi hàm lƣợng IL-2 đạt cao nhất ở điều kiện có bổ sung 1% glucose kết hợp 0,5% cao nấm men và 0,5 mM IPTG.