Tiêu chuẩn thực hành sản xuất tốt (Good Manufacturing Practice, GMP) áp dụng để quản lý sản xuất trong các ngành: dƣợc phẩm, mỹ phẩm, thiết bị y tế, thực phẩm,... là một phần của hệ thống quản lý chất lƣợng nhằm đảm bảo kiểm soát các điều kiện về nhà xƣởng (cơ sở hạ tầng), điều kiện con ngƣời và kiểm soát các quá trình sản xuất để đạt những tiêu chuẩn về an toàn vệ sinh cung cấp cho ngƣời tiêu dùng loại bỏ những nguy cơ nhiễm chéo và lẫn lộn, mang lại phƣơng thức quản lý chất lƣợng khoa học, hệ thống và đầy đủ, giảm các sự cố, rủi ro trong sản xuất, kinh doanh [59] [60]. Bắt nguồn từ năm 1933, Luật Thực phẩm Dƣợc phẩm và Mỹ phẩm của Hoa Kỳ đƣa ra yêu cầu thực hiện GMP trong quá trình sản xuất các sản phẩm Dƣợc phẩm và Mỹ phẩm [59]. Các yêu cầu của GMP luôn đƣợc cập nhập và mở rộng phạm vi trên nhiều lĩnh vực khác [59] [61]. Tại Việt Nam, từ năm 1997 đến nay, đã triển khai áp dụng yêu cầu GMP trên các lĩnh vực: thực phẩm, dƣợc phẩm, thuốc thú y, thuốc đông y.... [61]. Các tiêu chuẩn thực hành tốt sản xuất sinh phẩm đƣợc áp dụng cho các quy trình sản xuất sau: (i) nuôi cấy các chủng vi sinh vật và tế bào có nhân, (ii) chiết xuất hoạt chất từ mô ngƣời, động vật và mô thực vật, (iii) kỹ thuật DNA tái tổ hợp, (iv) kỹ thuật lai tạo, (v) nhân giống vi sinh vật trong phôi hoặc động vật. Các sinh phẩm đƣợc tạo ra từ những phƣơng pháp trên gồm có kháng nguyên, vắc xin, hormone, cytokine, enzyme,... Các tiêu chuẩn để thực hành tốt sản xuất sinh phẩm nhƣ: tiêu chuẩn về nhân sự, nhà xƣởng và thiết bị, khu chăn nuôi và chăm sóc động vật, sản xuất, ghi nhãn, hồ sơ lô và hồ sơ phân phối sản phẩm, đảm bảo chất lƣợng và kiểm tra chất lƣợng đƣợc trình bày chi tiết ở phần phụ lục II.
Công ty TNHH Một thành viên Vắc xin và Sinh phẩm số 1 (VABIOTECH) là một doanh nghiệp nhà nƣớc trực thuộc Bộ Y tế - Việt Nam đƣợc thành lập từ năm 2000. VABIOTECH là một trong những công ty hàng đầu trong lĩnh vực nghiên cứu, sản xuất và kinh doanh vắc xin, sinh phẩm dùng cho ngƣời ở Việt Nam với cơ sở vật chất sản xuất đạt các tiêu chuẩn WHO-GMP; hệ thống quản lý chất lƣợng ISO 9001 – 2008. Hiện tại, VABIOTECH sản xuất và kinh doanh 4 sản phẩm chính là vắc xin viêm gan A, vắc xin viêm gan B, vắc xin viêm não Nhật Bản và vắc xin Tả uống đƣợc sử dụng trong Chƣơng trình Tiêm chủng mở rộng Quốc gia - Việt Nam, thị trƣờng nội địa và xuất khẩu. Do vậy, việc nghiên cứu sản xuất IL-2 ngƣời tái tổ hợp tại phòng thí nghiệm đạt tiêu chuẩn GMP của công ty VABIOTECH là hoàn toàn đƣợc tin tƣởng sẽ tạo ra sản phẩm an toàn.
CHƢƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1. Chủng giống và plasmid
Chủng biểu hiện E. coli BL21 (DE3) của hãng Invitrogen.
Vector biểu hiện pET22-il2 desAla: là vector biểu hiện mang gen il2 cải biến, gen il2 đƣợc biểu hiện thành công trong vector pET22b(+) (của hãng Novagen) tại Phòng kỹ thuật di truyền, Viện Công nghệ sinh học.
Dòng tế bào CTLL2 dùng để xác định hoạt tính sinh học của IL-2 của hãng ATCC (Mỹ).
2.1.2. Hóa chất
Sodium Chloride, Bacto Trypton, Iso-propanol, Citric acid, 2- Mecaptoethanol, Cao nấm men, Sucrose, Glucose, Ethanol, Mannitol, Sodium acetate, Hydroxypropyl-β-cyclodextrin, PEG-400, Glycerol, Formaldehyde, nHexan, Acetic acid, Guanidine chloride, Aceton nitrile, TFA, Triton-X100, BisAcrylamide, nội độc tố chuẩn (CSE), PMSF, MTT, FBS, DMSO và các hóa chất khác thƣờng dùng trong sinh học phân tử và trong nuôi cấy tế bào động vật của các hãng tin cậy nhƣ Bio-Rad (Mỹ), Merck (Đức), Prolabo (Pháp), Lifetechnology (Mỹ), Sigma (Mỹ).
2.1.3. Máy móc và thiết bị
Hệ thống nồi lên men (Bioflo 115 và Marubishi), hệ thống HPLC (Shimadzu), máy lắc (IKA®KS 260 basic), máy siêu âm (Microson™), máy ly tâm nhỏ (Sorvall Biofuge Fresco), máy ly tâm lớn (Sorvall Legened RT), máy điện di protein, máy chuyển màng, máy nanodrop, máy đo quang phổ spectrophometer, kit xác định hàm lƣợng pyrogen LAL-test, bể ổn nhiệt và các máy khác thƣờng dùng trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử thuộc các hãng nổi tiếng nhƣ Bio-Rad, New Jersey (Mỹ),
2.1.4. Các môi trường và dung dịch
2.1.4.1. Môi trường sử dụng trong biểu hiện protein
Tên Thành phần
Môi trƣờng LB Cao nấm men (0,5%), Bacto trypton (1%), NaCl (1%) Môi trƣờng LBA Thành phần nhƣ môi trƣờng LB, sau đó bổ sung
Ampicillin đến nồng độ cuối cùng là 100 μg/ml Môi trƣờng bổ sung Glucose 40%, Cao nấm men 20%
2.1.4.2. Dung dịch sử dụng trong tiền tinh chế protein Interleukin-2
Tên Thành phần
Đệm I (Buffer I) Tris 20 mM, EDTA 10 mM, PMSF 0,05 mM Đệm II (Buffer II) Buffer I + TritonX100 0,1%
Đệm III (Buffer III) Sucrose 60%
Đệm IV (Buffer IV) Tris 50 mM, EDTA 10 mM, Guanidine HCl 7 M
2.1.4.3. Dung dịch sử dụng trong chạy hệ thống sắc ký HPLC
Tên Thành phần
Đệm A (Buffer A) 0,5% Acid citric
Đệm B (Buffer B) 0,5% Acid citric, 60% Iso-propanol
2.1.4.4. Dung dịch sử dụng trong điện di SDS - PAGE
Các loại hóa chất cần thiết cho đổ gel: Bis-acrylamide 30%, Glycerol 50%, Tris HCl 1,5 M (pH = 8,8), Tris HCl 0,5 M (pH = 6,8), APS 10%, TEMED.
Đệm xử lý mẫu trƣớc khi điện di (Treatment buffer 6X): Tris HCl 0,36 M (pH=8), Glycerol 60%, SDS 12%, Bromophenol blue (0,06%), 2-mecaptoethanol 3/10 (v/v).
Đệm chạy điện di: Glycine 192 mM, Tris base 25 mM, SDS 0,1%. Công thức cho 2 bản gel SDS-PAGE (gồm 2 lớp gel tách và gel cô):
Hóachất Gel tách(12,6%) Gel cô(5%)
H2O 1 ml 1,3 ml Tris-HCl 1,5 M (pH 8,8) 2,25 ml 0 ml Tris-HCl 0,5 M (pH 6,8) 0 ml 0,5 ml Glycerol 50% 1,8 ml 0 ml Acrylamide 30% 3,8 ml 0,35 ml SDS 10% 90 μl 10 μl APS 10% 60 μl 20 μl TEMED 6 μl 2 μl
2.1.4.5. Dung dịch sử dụng để hiện kết quả điện di SDS – PAGE
Dung dịch sử dụng cho phƣơng pháp nhuộm Coomassie:
Dung dịch nhuộm gel (Coomassie blue staining): Coomassie Brilliantblue: 0,025%; Methanol 40%; Acid acetic: 10%.
Dung dịch tẩy rửa (Destaining): Methanol: 5%, Acid acetic: 7,5%. Dung dịch sử dụng cho phƣơng pháp nhuộm bạc (silver stainning):
Dung dịch cố định (Fixing solution): Ethanol 50%, Acetic acid 12%, Formaldehyde 0,05%.
Dung dịch rửa (Washing solution): Ethanol 50%.
Dung dịch nhạy hóa (Sensitising solution): Na2S2O3. 5H2O 0,02%.
Dung dịch nhuộm bạc (Silver staining solution): AgNO3 0,2%, Formaldehyde 0,075%.
Dung dịch hiện màu (Developing solution): Na2CO3 6%, Na2S2O3. 5H2O 0,0004%, Formaldehyde 0,05%.
Dung dịch dừng phản ứng (Stopping solution): Glycine 1%.
2.1.4.6. Dung dịch sử dụng trong phản ứng Western blot
Tên Thành phần
Dung dịch blotting
Tris-HCl 25mM pH=8, Glycine 190 mM, Methanol 20%
Dung dịch TBS Dung dịch TBS
Dung dịch TTBS Tris-HCl 25 mM pH=8, NaCl 50 mM, Tween20 0,1%
2.1.4.7. Dung dịch sử dụng trong phương pháp ELISA
Tên Thành phần
Đệm phủ 4,2 g NaHCO3, 5,3 g Na2CO3, thêm H2O để đạt thể tích 1 lít, chuẩn pH = 9,6
PBS 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,15 g Na2HPO4, 0,2 g K2HPO4, thêm H2O để đạt thể tích 1 lít, chuẩn pH = 8
Dung dịch rửa 500 µl Tween 20, 1 lít PBS
Dung dịch khóa 10 g BSA (Bovine serum albumin), 1 lít PBS Dung dịch pha
loãng kháng thể 1
0,1 g BSA, 0,01 g Cold fish gelatin, 5 µl Tween 20, 10 ml PBS
Dung dịch pha loãng kháng thể 2
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Biểu hiện protein Interleukin-2 tái tổ hợp trong tế bào E. coli ở các hệ thống lên men 5 và 10 lít lên men 5 và 10 lít
Cơ sở lý thuyết
Tế bào vi khuẩn E. coli tái tổ hợp mang gene tổng hợp IL-2 đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng LBA ở nhiệt độ và độ sục khí thích hợp cho việc sinh trƣởng. Nhờ cơ chế cảm ứng operon lac bằng hóa chất IPTG, protein IL-2 đƣợc tổng hợp.
Các bƣớc tiến hành
Chuẩn bị 2,8 và 5,6 lít (gọi là V lít) môi trƣờng LB tƣơng ứng trong các hệ thống lên men 5 và 10 lít. Sục khí và khuấy để bão hoà nguồn oxy trong môi trƣờng trƣớc khi lên men. Nuôi cấy 1V/14 lít chủng giống E. coli BL21-IL2 qua đêm tại nhiệt độ 37°C trong môi trƣờng LB có bổ sung Amp 100 μg/ml. Bổ sung toàn bộ dịch nuôi cấy qua đêm vào bình lên men. Điều kiện lên men ban đầu là: nhiệt độ 37°C, pH môi trƣờng khoảng 6,0 - 7,0, độ sục khí là 0,5 lít khí sục vào/lít môi trƣờng/phút (vvm), tốc độ khuấy 200 vòng/phút.
Sau 2 giờ nuôi cấy, tăng tốc độ khuấy lên 400 vòng/phút, sau 3 giờ tăng 600 vòng/phút và tăng sục khí lên 1 vvm. Nuôi cấy chủng đến khi chỉ số dOT (nồng độ oxy hòa tan trong môi trƣờng) giảm xuống dƣới 20% thì bổ sung dinh dƣỡng lần thứ nhất với nồng độ cuối cùng 1% glucose và 0,5% cao nấm men.
Tiếp tục duy trì tốc độ khuấy 600 vòng/phút và độ sục khí 1 vvm để tăng sinh khối tế bào sau lên men. Nuôi cấy đến khi dOT giảm xuống dƣới 20% thì tiến hành bổ sung dinh dƣỡng lần thứ hai với nồng độ cuối cùng 1% glucose và 0,5% cao nấm men. Khi giá trị OD600 khoảng từ 15 đến 20, tăng nhiệt độ lên đạt 47°C bổ sung 0,1 mM IPTG để cảm ứng quá trình sinh tổng hợp protein IL-2.
Tiếp tục kiểm tra mật độ tế bào theo thời gian sau khi cảm ứng. Mẫu đƣợc lấy tại các giờ khác nhau và dừng lên men sau 6 giờ cảm ứng. Sinh khối tế bào sau quá trình lên men đƣợc ly tâm loại bỏ môi trƣờng và tế bào đƣợc hòa lại trong đệm Tris- HCl 20 mM và giữ ở -80°C.
2.2.2. Phá tế bào E. coli và xử lý IL-2 thô (tiền tinh chế)
Dịch tế bào E. coli thu lại sau quá trình biểu hiện đƣợc xử lý bằng các loại dung dịch đệm đặc trƣng, sau đó thành và màng tế bào đƣợc phá vỡ bằng sóng siêu âm. Protein dạng thể vùi không tan trong dung môi nƣớc nên có thể dễ dàng loại bỏ các protein tan khác nhờ phƣơng pháp ly tâm. Protein thể vùi chỉ chuyển thành dạng tan khi xử lý bằng các chất có khả năng biến tính cao nhƣ urea hay guanidine hydrochloride. Các protein khác nhau trong thể vùi có khả năng trở thành dạng tan ở những nồng độ chất biến tính khác nhau nên có thể đƣợc phân tách chúng bằng phƣơng pháp ly tâm.
Phƣơng pháp xử lý tiền tinh chế IL-2
Sinh khối tế bào đƣợc giã đông ở nhiệt độ 37ºC trong 30 phút, sau đó bổ sung dung dịch đệm I và đƣợc xử lý siêu âm phá tế bào trong10 phút. Ly tâm 5000 vòng/phút trong 10 phút và tủa thu đƣợc hòa tiếp trong dung dịch đệm II. Tiếp tục siêu âm tƣơng tự lần hai trong 10 phút. Dịch siêu âm đƣợc bổ sung sucrose đến nồng độ cuối cùng là 20% và ly tâm ở 10000 vòng/phút trong 20 phút. Tủa đƣợc hòa lại trong 5 ml dung dịch đệm IV đến khi tan hoàn toàn trƣớc khi ly tâm 10000 vòng/phút trong 30 phút để thu dịch nổi. Dịch nổi đƣợc pha loãng bằng đệm Tris- HCl 20 mM để đƣa nồng độ guanidine hydrochloride (GnHCl) từ 7 M xuống 3 M, ủ ở nhiệt độ phòng trong 60 phút. Hỗn hợp sau khi ủ đƣợc ly tâm 10000 vòng/phút trong 30 phút để thu tủa. Tủa đƣợc hòa tan trong 2,5 ml đệm IV có bổ sung 2- Mecaptoethanol đến nồng độ 15 mM và khuấy trong điều kiện 4ºC từ 8 đến 10 giờ. Dịch hòa tan đƣợc ly tâm 10000 vòng/phút trong 30 phút, loại tủa, thu dịch nổi.
2.2.3. Tinh chế IL-2 bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
Cơ sở lý thuyết
Phƣơng pháp sắc ký lỏng HPLC là phƣơng pháp phân tách bao gồm 2 pha, trong đó pha động là chất lỏng (dịch protein cần phân tách) và pha tĩnh chứa trong cột chất rắn đã đƣợc phân chia dƣới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn, hay một chất mang đã đƣợc cải biến bằng liên kết hóa học với các nhóm chức hữu cơ. Sắc ký đảo pha phân tách IL-2 nhờ vào sự khác nhau giữa tính phân cực của các phân tử protein.
Mẫu IL-2 thu đƣợc sau quá trình phá sinh khối tế bào và xử lý thô tiền tinh chế đƣợc bổ sung TFA đến nồng độ cuối cùng là 15 mM, ly tâm 13000 vòng trên phút trong 10 phút, thu dịch nổi. Sau đó mẫu đƣợc đƣa lên cột theo chƣơng trình đã đƣợc thiết lập.
Các thông số cơ bản của quá trình tinh chế: (i) cột sắc ký để phân tách mẫu Bio Wide Pore C5 (10 mm x 250 mm, 10 μm) (Supelco); (ii) thành phần đệm A và B đã nêu trên; (iii) mẫu đƣợc đƣa lên cột bằng cách bơm qua bộ phận hút mẫu; (iv) hệ thống phát hiện mẫu sử dụng đèn quang phổ cực tím trong đó bƣớc sóng phát hiện mẫu là 280 nm; (v) thể tích mẫu mỗi lần hút là 2 ml; (vi) tốc độ dòng 20 ml/phút.
Chƣơng trình chạy: 5 phút đầu tiên chạy gradient từ 0 đến 20% đệm B, 10 phút tiếp theo từ phút thứ 6 đến phút thứ 15 duy trì nồng độ 90% đệm B, 5 phút còn lại từ phút thứ 16 đến phút thứ 20 duy trì nồng độ 0% đệm B.
Sau khi chƣơng trình chạy mẫu trên hệ HPLC kết thúc, mở sắc ký đồ kết quả để phân tích và xác định độ tinh khiết của sản phẩm. Lƣu ý thu mẫu trong khoảng từ phút thứ 9 đến phút 12, thu theo phân đoạn.
2.2.4. Xác định hoạt tính sinh học protein Interleukin-2 trên dòng tế bào CTLL2
Nguyên lý
Dựa vào đặc tính của dòng tế bào CTLL2 là tế bào sinh trƣởng phụ thuộc hoàn toàn vào IL-2, khi môi trƣờng nuôi cấy dòng tế bào CTLL2 không đƣợc bổ sung IL- 2 thì tế bào sẽ chết trong khoảng 24-48 giờ. Khi bổ sung IL-2 vào môi trƣờng nuôi cấy dòng tế bào CTLL2 thì tùy thuộc vào hoạt tính của IL-2 mà tế bào CTLL2 sẽ duy trì sự sống và đƣợc kích hoạt để phát triển và sinh sản. Hoạt tính của IL-2 càng mạnh thì khả năng tăng sinh của tế bào CTLL2 càng cao. Sự hoạt động của IL-2 đƣợc xác định bằng cách đo tổng số thimidine từ ADN tổng hợp của các tế bào CTLL2 tăng sinh.
Phƣơng pháp hoạt hóa và duy trì tế bào CTLL-2
Chuẩn bị sẵn ống ly tâm có chứa 10 ml môi trƣờng nuôi cấy RPMI-1640 đầy đủ có bổ sung 10% FBS. Sau đó, lấy ống tế bào giữ chủng tế bào CTLL2 từ trong nitơ lỏng và đƣa ngay vào nƣớc ấm 37°C. Khi dung dịch bên trong ống đã tan đá
hoàn toàn, chuyển ngay dung dịch bên trong ống giữ chủng sang ống ly tâm đã chuẩn bị sẵn môi trƣờng nuôi cấy (bƣớc này để pha loãng nồng độ DMSO (Dimethyl Sulfoxide) giúp giảm sự gây độc của nó đối với tế bào ở nhiêt độ thƣờng), ly tâm với tốc độ 1000 vòng/phút trong 5 phút. Sau đó hút bỏ dịch nổi để loại DMSO có trong ống giữ chủng. Tiếp theo hòa cặn tế bào bằng môi trƣờng nuôi cấy là RPMI-1640đầy đủ có bổ sung 10% FBS, hút và chuyển từ từ dung dịch tế bào sang chai nuôi cấy thích hợp, bổ sung IL-2. Cuối cùng để chai nuôi vào ủ trong tủ 37°C, CO2 5% có độ ẩm. Sau 3-5 ngày thì cấy chuyển nhằm duy trì tế bào. Tế bào đƣợc sử dụng để làm phép xác định hoạt tính sau ít nhất 2 ngày kể từ khi cấy chuyển.
Phƣơng pháp MTT assay
Hòa loãng mẫu IL-2 tái tổ hợp và mẫu IL-2 chuẩn (USA hoặc China) trong 50 µl môi trƣờng RPMI-1640đầy đủ có bổ sung 10% FBS vào các giếng đầu tiên trong đĩa microtiter 96 giếng, mỗi một mẫu đƣợc lặp lại 3 lần. Các giếng đối chứng âm chỉ có tế bào và môi trƣờng nuôi cấy, không có IL-2. Sau tối thiểu 2 ngày nuôi cấy, khi tế bào ở pha log thì tiến hành thu tế bào CTLL-2 và rửa bằng môi trƣờng RPMI- 1640đầy đủ để loại bỏ IL-2 còn dƣ thừa trong quá trình nuôi cấy tế bào, tránh ảnh hƣởng đến quá trình làm phép xác định hoạt tính. Hòa cặn tế bào thu đƣợc sau khi ly tâm để đạt mật độ 106 tế bào/ml và nhỏ mỗi giếng thí nghiệm 50 µl. Đĩa thí nghiệm đƣợc ủ trong tủ 37°C, 5% CO2 có độ ẩm. Sau 24 giờ nuôi, bổ sung 10 µl MTT (5 mg/ml pha trong PBS) vào từng giếng (chứa 100 µl tế bào), ủ tế bào 4 giờ trong tủ nuôi 37°C, CO2 5% có độ ẩm. Sau 4 giờ ủ với MTT lấy đĩa nuôi cấy bổ sung 100 µl isopropanol HCl 0,04N vào mỗi giếng, mix bằng pipet mạnh nhiều lần để hòa tan các tinh thể mầu xanh đậm, để đĩa ở trạng thái tĩnh khoảng 3 – 5 phút. Đọc kết quả bằng bƣớc sóng 595 nm.
Phân tích kết quả
Sau khi có kết quả đo mật độ quang học (OD), phần mềm Graphpad Prism 5.0 đƣợc sử dụng để tính giá trị EC50 (half maximal effective concentration, EC50: là