Trong quá trình lên men lần hai này, chúng tôi đã thay đổi một số điều kiện nhƣ giảm nồng độ IPTG cảm ứng xuống 0,1 mM, giảm bổ sung dinh dƣỡng xuống 2 lần và tăng thời gian thu mẫu lên 6 giờ sau cảm ứng với mục đích thu đƣợc nhiều protein IL-2 hơn. Nồng độ chất cảm ứng IPTG đƣợc giảm xuống chỉ còn 0,1 mM với mục đích giảm sự ức chế sinh trƣởng của tế bào do nồng độ IPTG cao có thể gây độc đối với tế bào. Cùng với việc giảm số lần bổ sung dinh dƣỡng và tăng thời gian thu mẫu để tế bào có thể sử dụng hết nguồn dinh dƣỡng bổ sung và tăng quá trình tổng hợp protein đích IL-2, tránh trƣờng hợp nguồn dinh dƣỡng còn dƣ nhiều ra ngoài môi trƣờng nuôi cấy, gây khó khăn cho quá trình tiền tinh chế và tinh chế về sau.
Quá trình lên men 10 lít đợt 2 đƣợc tiến hành ở điều kiện nhiệt độ nhiệt độ 47ºC có bổ sung dinh dƣỡng hai lần vào các thời điểm lên men 3 và 5,5 giờ, đồng thời cảm ứng IPTG nồng độ cuối cùng 0,1mM khi OD600 đạt 16,3 tại thời điểm lên men sau 5,5 giờ. Quá trình lên men kết thúc sau 6 giờ cảm ứng (tƣơng ứng sau 10,5 giờ lên men). Đƣờng cong sinh trƣởng của chủng E. coli BL21-IL-2 trong hệ thống lên men 10 lít đợt 2 đƣợc thể hiện trên Hình 3.5.
Hình 3. 5: Đƣờng cong sinh trƣởng của chủng tái tổ hợp E. coli BL21-IL2 đợt 2 Đƣờng cong sinh trƣởng thể hiện trên Hình 3.5 cho thấy chủngE. coli BL21- IL2 vẫn phát triển tốt mặc dù có sự khác biệt về quy trình biểu hiện IL-2 so với đợt 1 khi giảm sự bổ sung dinh dƣỡng xuống 2 lần và giảm nồng độ chất cảm ứng IPTG xuống 0,1 mM. Theo quy trình này thời gian thu mẫu đã đƣợc tăng lên từ 3 giờ lên 6 giờ và giá trị OD600 thu mẫu đạt khoảng OD600 là 18. Nhƣ vậy, quy trình này sẽ tiết kiệm đƣợc chi phí lên men do giảm thành phần bổ sung dinh dƣỡng và giảm nồng độ IPTG. Để kiểm tra khả năng biểu hiện của chủng này chúng tôi đã điện di kiểm tra sản phẩm lên men trên SDS-PAGE với các mẫu lên men thu đƣợc ở các giờ khác nhau sau khi cảm ứng (Hình 3.6).
Hình 3. 6: Điện di Protein tổng số khi biểu hiện chủng E. coli BL21-IL2 trong hệ thống lên men 10 lít đợt 2
M: Thang protein chuẩn; Đƣờng chạy 1-6: Protein tổng số lên men sau 1-6 giờ cảm ứng IPTG; Đƣờng chạy 7: Protein tổng số biểu hiện trong bình tam giác. Kết quả trên Hình 3.6 cho thấy lƣợng protein đƣợc tổng hợp tăng dần sau khi cảm ứng IPTG (từ 1 đến 6 giờ) và gần nhƣ tƣơng đƣơng với lƣợng protein đƣợc biểu hiện trong bình tam giác theo nghiên cứu của nhóm tác giả Lê Thị Lan Anh (2013). Hàm lƣợng protein IL-2 tái tổ hợp thu đƣợc sau 6 giờ cảm ứng đƣợc xác định bằng phƣơng pháp ELISA đạt khoảng 0,86 mg/ml tƣơng ứng với băng protein IL-2 trên Hình 3.6 (đƣờng chạy 6), cao gấp 4 lần so với hàm lƣợng protein IL-2 lên men 10 lít đợt 1 và gấp 1,4 lần so với hàm lƣợng protein IL-2 biểu hiện trong bình tam giác của nhóm tác giả Lê Thị Lan Anh (2013). Kết quả tối ƣu quá trình lên men này trong hệ thống lên men 10 lít tƣơng đối tốt, vì vậy quy trình lên men này hoàn toàn phù hợp để tiến hành lên men quy mô lớn hơn trong điều kiện đạt tiêu chuẩn GMP.