Sinh khối tế bào của 2 đợt lên men 10 lít nói trên đƣợc xử lý theo quy trình tiền tinh chế đã trình bày ở phần phƣơng pháp. Mục đích của quá trình tiền tinh chế là để loại bỏ một số protein tạp trƣớc khi đƣa lên hệ thống HPLC tinh chế. Các protein tạp đƣợc loại bỏ bằng cách tủa với GuHCl ở các nồng độ khác nhau và có thể loại bỏ đƣợc đa số các protein không mong muốn. Kết quả kiểm tra quá trình tiền tinh chế của các sản phẩm lên men đƣợc trình bày trên Hình 3.7.
Hình 3. 7: Kiểm tra sản phẩm tiền tinh chế của 2 đợt lên men trong hệ thống 10 lít M: Thang protein chuẩn, Đƣờng chạy 1: IL-2 chuẩn, Đƣờng chạy 2 - 3: sản phẩm tiền tinh chế protein IL-2 thu đƣợc sau đợt lên men 1 – 2, Đƣờng chạy 4: sản phẩm
tiền tinh chế protein IL-2 biểu hiện trong bình tam giác.
Kết quả kiểm tra sản phẩm tiền tinh chế của 2 đợt lên men trong hệ thống lên men 10 lít trên Hình 3.7 cho thấy đa số các protein tạp không mong muốn đã đƣợc loại bỏ. Sản phẩm IL-2 (băng có kích thƣớc khoảng 15 kDa) tƣơng đối đậm và rõ nét hơn rất nhiều so với các băng protein khác (đƣờng chạy 2, 3, 4). Khi so sánh hai đợt lên men với nhau cho thấy kết quả mẫu lên men đợt 1 (đƣờng chạy 2) lƣợng protein IL-2 thu đƣợc ít hơn so với lên men đợt 2 (đƣờng chạy 3) và vẫn còn nhiều protein tạp hơn. Bên cạnh đó, kết quả trên còn cho thấy sản phẩm tiền tinh chế
protein IL-2 đợt 2 (đƣờng chạy 3) tƣơng đối giống với sản phẩm tiền tinh chế mẫu lên men trong bình tam giác(không có sự bổ sung chất dinh dƣỡng - đƣờng chạy 4). Việc giảm số lần bổ sung dinh dƣỡng trong quá trình lên men có thể dẫn đến giảm sự biểu hiện các protein khác. Có thể nói,việc thay đổi một số điều kiện của quy trình lên men đợt 2 là hoàn toàn phù hợp và cho kết quả cao, không khác biệt nhiều so với kết quả thực hiện trong nghiên cứu ở quy mô nhỏ trƣớc đó. Nhƣ vậy, chất lƣợng của đợt lên men thứ 2 một lần nữa đƣợc khẳng định là rất tốt và đạt tiêu chuẩn tiến hành các bƣớc tiền tinh chế cũng nhƣ tinh chế quy mô lớn trong điều kiện đạt tiêu chuẩn GMP.
3.3. Tinh chế IL-2 bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
Kết thúc quá trình xử lý tiền tinh chế, IL-2 đƣợc hòa tan trong dung dịch chứa 50 mM Tris, 10 mM EDTA, 7 M GuHCl và 15 mM 2- mecaptoethanol (có tác dụng ngăn cản sự hình thành của liên kết disulfide) bằng cách khuấy nhẹ bằng máy khuấy từ qua đêm ở điều kiện 4ºC. Để giúp ổn định và bảo vệ chất giá có bản chất gel silica trong cột sắc ký thì giá mẫu protein sau xử lý tiền tinh chế đƣợc bổ sung TFA để hạ pH của dung dịch xuống còn khoảng 2-3 (pH môi trƣờng thấp ngăn cản sự hình thành các nhóm chức có khả năng ion hóa của chất giá). Lý do lựa chọn TFA mà không phải một loại acid khác là vì:(i) TFA có độ hấp thụ ánh sáng tử ngoại khá thấp nên không ảnh hƣởng tới kết quả đo sự phát hiện của protein bằng độ hấp thụ quang học, (ii) TFA là một chất dễ bay hơi, dễ dàng loại bỏ trong quá trình đông khô, rất thuận tiện cho việc sản xuất chế phẩm thuốc. Dịch IL-2 sau đó đƣợc ly tâm 10000 vòng trên phút để loại bỏ các thành phần tủa còn sót lại của quá trình xử lý tiền tinh chế và thu dịch nổi để chuẩn bị cho việc đƣa mẫu lên cột HPLC. Quá trình tinh chế dịch IL-2 tái tổ hợp đƣợc tiến hành nhƣ đã mô tả trong phần phƣơng pháp. Kết quả tinh chế đƣợc thể hiện chi tiết trên sắc ký đồ HPLC và kết quả điện di kiểm tra sản phẩm IL-2 tinh chế trên Hình 3.9.
Hình 3. 8: Sắc ký đồ tinh chế IL-2 trên hệ thống HPLC
Dựa trên sắc ký đồ ta thấy xuất hiện một đỉnh hấp thụ (peak) lớn nhất tại thời điểm phút thứ 9,4 đến phút thứ 10, thu đƣợc 2 phân đoạn32 và 33 tƣơng ứng với đỉnh hấp thụ là 670 mAU và 280 mAU. Kết quả này đồng nhất ở các lần tinh chế tiếp theo cho thấy tính ổn định và khả năng phân tách tốt của mẫu xử lý trên cột bán điều chế Bio wide pore C5. Ngoài ra, trên sắc ký đồ còn xuất hiện một vài peak phụ tách nhau hoàn toàn ở vài phút trƣớc đó, chúng tôi đã kiểm tra trong các lần tinh chế trƣớc và thấy rằng đây là một số tạp chất cần loại bỏ, điều này chứng tỏ protein IL-2 đã đƣợc phân tách ra khỏi các loại protein tạp khác từ mẫu xử lý thô. Hai phân đoạn 32 và 33 đƣợc thu lại để kiểm tra bằng SDS-PAGE và Western Blotting.
Hình 3. 9: Kết quả kiểm tra protein IL-2 sau khi tinh sạch bằng hệ thống HPLC A: Điện di SDS-PAGE và nhuộm bạc. B: Kết quả lai miễn dịch Western blotting. M: Thang protein chuẩn, Đƣờng chạy 1 - 2: Dịch protein trong phân đoạnsố32 - 33
thu đƣợc sau khi tinh sạch.
Kết quả trên Hình 3.9 cho thấy hai băngđiện di phân đoạn 32 và 33 có kích thƣớc khoảng gần 15 kDa đúng với kích thƣớc tính toán, tuy chúng có độ đậm khác nhau nhƣng điều đặc biệt là chúng đều có độ tinh sạch cao (không xuất hiện bất kỳ băng protein nào khác ngoài IL-2) đƣợc thể hiện rõ bởi phản ứng có độ nhạy cao SDS-PAGE nhuộm bạc (Hình 3.9 A). Bằng kỹ thuật lai miễn dịch Western Blotting, sử dụng kháng thể đặc hiệu với IL-2 cho thấy băng protein duy nhất chính là IL-2 (Hình 3.9 B). Hàm lƣợng protein của hai phân đoạn 32 và 33 đƣợc xác định bằng phƣơng pháp ELISA là 0,667 mg/mL và 0,275 mg/mL tƣơng ứng với sự khác nhau về độ cao của hai đỉnh hấp thụ trên sắc ký đồ. Điều này hoàn toán đúng theo định luật Beer, độ hấp thụ ánh sáng quang học của một dung dịch tỷ lệ thuận với nồng độ của dung dịch [38]. Vì vậy, quy trình tinh chế đƣợc áp dụng là phù hợp để tinh chế mẫu protein IL-2 và có thể sử dụng để tiến hành ở các lần tinh chế tiếp theo.
3.4. Xác định hoạt tính sinh học của IL-2 trên dòng tế bào CTLL2
Trƣớc khi xác định hoạt tính sinh học riêng của sản phẩm IL-2 tái tổ hợp sau khi tinh sạch, hàm lƣợng protein có trong hai mẫu phân đoạn 32 và 33 đƣợc xác định bằng phƣơng pháp ELISA và đƣa về cùng nồng độ là 5 µg/mL (bằng với nồng độ của IL-2 chuẩn (Roche- Hoa Kỳ)) tạo thành dung dịch gốc cho thí nghiệm. Để bắt đầu thí nghiệm dung dịch gốc đƣợc chúng tôi đƣa về nồng độ ban đầu là 100 ng/mL, từ đó mỗi giếng thí nghiệm chúng tôi pha loãng mẫu 3 lần, tổng số giếng thí nghiệm cho một lần chạy mẫu là 11 giếng. Mỗi mẫu đƣợc lặp lại 3 lần để đảm bảo độ chính xác.
Hình 3. 10: Biểu đồ thể hiện sự kích thích tăng sinh tế bào CTLL-2 của các mẫu IL-2 tái tổ hợp
(trích từ kết quả phân tích dữ liệu bằng phần mềm GraphPad Prism 5)
Sự kích thích tăng sinh tế bào CTLL2 của các mẫu IL2 tái tổ hợp sau khi tinh chế đƣợc thể hiện trên Hình 3.10, cho thấy cả hai mẫu IL-2 tái tổ hợp do chúng tôi
tạo ra và mẫu IL-2 chuẩn (Roche) đều có khả năng hoạt hóa và duy trì sự sống cho tế bào CTLL2. Giá trị R2
của 3 mẫu đạt từ 0,95 đến 0,99, chứng tỏ thí nghiệm xác định hoạt tính có độ chuẩn xác cao. Mẫu thí nghiệm S1 (phân đoạn 32) và S2 (phân đoạn 33) có chỉ số EC50 gần tƣơng đƣơng nhau, lần lƣợt đạt 0,4987 và 0,4367.Trong khi đó, mẫu IL-2 chuẩn của hãng Roche có EC50 cao hơn hai mẫu thí nghiệm đạt 0,6352. Nhƣ vậy, hai mẫu IL2 tái tổ hợpcó hoạt tính sinh học cao hơn mẫu IL-2 chuẩn của Roche(do EC50 càng thấp thì hoạt tính sinh học càng cao).
Sau khi quy đổi đơn vị hoạt tính sinh họcriêng theo chuẩn quốc tế (công thức quy đổi đã đƣợc trình bày ở phần phƣơng pháp), kết quả quy đổi đƣợc thống kê ở Bảng 3.2. Các mẫu IL-2 tái tổ hợp do Việt Nam tạo ra có hoạt tính sinh học riêng tƣơng đối tốt S1 (13,19 x 106 IU/mg) và S2 (14,19 x 106 IU/mg). Mẫu IL-2 của Roche có hoạt tính riêng thấp hơn chỉ đạt 10,36 x 106 IU/mg.
Bảng 3. 2: Giá trị EC50 và hoạt tính riêng của các mẫu IL-2
Tên mẫu Giá trị EC50 (ng/mL) Hoạt tính riêng (U/mg) Hoạt tính riêng (IU/mg) Giá trị R2 rhIL2-desAlaS1 0.4987 2.00 x 106 13.19 x 106 0.95 rhIL2-desAlaS2 0.4637 2.15 x 106 14.19 x 106 0.99 IL-2 chuẩn (Roche) 0.6352 1.57 x 106 10.36 x 106 0.99
rhIL2 7.4 1,3 x 105 8,90 x 105 - Proleukin (hoạt tính
do hãng công bố) - - 16.36 x 10
6
-
Sản phẩm protein IL-2 ngƣời tái tổ hợp dạng cải biến(ký hiệu rhIL2-desAla) có trình tự axit amin hoàn toàn giống với sản phẩm Proleukin của Hoa Kỳ. Khi so sánh với sản phẩm IL-2 pha nghiên cứu trƣớc thuộc đề tài nghiên cứu cấp nhà nƣớc KC.04.21/06-10 (ký hiệu rhIL2), trình tự axit amin của sản phẩm này chỉ khác (ít hơn) đúng một axit amin Alanine ở đầu N của phân tử, tuy nhiên hoạt tính của sản
phẩm này (14,19 x 106) cao gấp khoảng 14 lần so với sản phẩm của đề tài KC.04.21/06-10 (0,89 x 106) (Hình 3.11). Bên cạnh đó, khi so sánh với IL-2 chuẩn của hãng Roche và sản phẩm thƣơng mại Proleukin, sản phẩm IL-2 tái tổ hợp của Việt Nam có hoạt tính sinh học riêng tƣơng đƣơng với IL-2 chuẩn của hãng Roche và gần bằng sản phẩm thƣơng mại Proleukin (16,36 x 106 IU/mg)[12][51], tất cả đƣợc thể hiện trên Hình3.11.
Hình 3. 11: So sánh hoạt tính sinh học riêng của các mẫu IL-2
3.5. Xác định độ tinh sạchcủa protein IL-2 tái tổ hợp sau tinh chế bằng phần mềm Quantity One
Phần mềm Quantity One của BioRad là phần mềm thông dụng và đƣợc sử dụng nhiều trên thế giới để xác định độ đậm nhạt của các băng protein trên điện di đồ. Để xác định đƣợc chính xác độ tinh khiết của protein IL-2, chúng tôi sử dụng ảnh điện di trên gel polyacrylamide bằng kỹ thuật SDS – PAGE nhuộm Coomassie và xử lý bằng phần mềm chuyên dụng Quantity One. Cách thao tác trên phần mềm nhƣ đã trình bày trong phần phƣơng pháp. Kết quả thu đƣợc thể hiện trong Hình 3.12.
Hình 3. 12:Kiểm tra độ tinh sạch của protein IL-2 bằng QuantityOne
Hình3.12cho thấy xuất hiện duy nhất một đỉnh hấp phụ tƣơng ứng với vị trí băng protein trên bản gel điện di. Mẫu IL-2 sau tinh chế khi quét chỉ phát hiện một băng duy nhất ứng với băng protein IL-2 chứng tỏ mẫu có độ sạch khá cao.
Hình 3. 13: Kết quả độ tinh sạchcủa IL-2 xác định bằng phần mềm Quantity One Từ kết quả phần mềm đƣa ra cho thấy, sản phẩm IL-2 tái tổ hợp có độ sạch 99,3%. Nhƣ vậy IL-2 sau tinh chế đạt tiêu chuẩn về độ tinh khiết cho sản phẩmdạng
thuốc tiêm và truyền tĩnh mạch theo cơ quan quản lý Dƣợc phẩm và Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA).
3.6. Xác định hàm lƣợng nội độc tố trong sản phẩm IL-2 sau tinh chế
Để kiểm tra tính an toàn của sản phẩm IL-2 chúng tôi tiến hành xác định hàm lƣợng nội độc tố trong mẫu protein IL-2 tái tổ hợp sau tinh chế bằng LAL kit. Để tăng độ tin cậy cho phép thử chúng tôi tiến hành lặp lại 3 lần và kết quả thu đƣợc thể hiện trên Hình 3.14.
Hình 3. 14: Hình ảnh kết quả sau khi dừng phản ứng đông gel
Độ nhạy của dung dịch LAL đƣợc cung cấp là 0,25 EU/ml, có nghĩa là với mẫu có nồng độ nội độc tố lớn hơn hoặc bằng 0,25 EU/ml sẽ cho kết quả dƣơng tính (tạo gel). Ở mẫu đối chứng dƣơng (nội độc tố chuẩn CSE + LAL), sau khi ủ 37ºC trong 1 giờ cho kết quả dƣơng tính, dịch trong ống eppendorf chuyển sang trạng thái gel và khi dốc ngƣợc 180º vẫn đọng lại ở đáy ống thể hiện rất rõ ràng trên Hình 3.14. Ở mẫu đối chứng âm (dH20 tại công ty VABIOTECH + LAL) và mẫu cần kiểm tra nội độc tố (sản phẩm IL-2 sau tinh chế + LAL) đều cho kết quả âm tính, saukhi dừng phản ứng toàn bộ dịch vẫn ở trạng thái lỏng và khi dốc ngƣợc 180º thì chảy hoàn toàn xuống miệng ống, chứng tỏ dịch IL-2 sau tinh chế có nồng độ nội độc tố nhỏ hơn 0,25 EU/ml. Cả 3 lần thí nghiệm đều cho kết quả nhƣ nhau cho thấy tính ổn định cũng nhƣ đảm bảo chính xác mẫu protein thu đƣợc đáp ứng tiêu chuẩn của sản phẩm tiêm là nồng độ nội độc tố không quá 0,5 EU/ml.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
Sau quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi đã hoàn thiện đƣợc quy trình sản xuất protein IL-2, đáp ứng đƣợc yêu cầu về chất lƣợng tại điều kiện phòng sản xuất đạt tiêu chuẩn GMP tại Công ty VABIOTECH.Một số kết quả cụ thể nhƣ sau:
1. ... Đ ã biểu hiện thành công protein IL-2 tái tổ hợp dạng cải biếntrong hệ thống lên men 10 lít,với điều kiện nhiệt độ là 47°C, bổ sung hai lần dinh dƣỡng (glucose 1% và cao nấm men 0,5%), cảm ứng IPTG 0,1 mM và thu mẫu sau 6 giờ cảm ứng. Hàm lƣợng protein IL-2 thu đƣợc sau quá trình lên men đạt 0,86 mg/ml. 2. ... Đ
ã tinh chế thành công sản phẩm IL-2 bằng cột bán điều chế của hệ thống sắc ký HPLC với hàm lƣợng protein IL-2 thu đƣợc sau quá trình tinh chế đạt 0,667 mg/ml.
3. ... Đ ã xác định đƣợc hoạt tính sinh học của sản phẩm IL-2 đạt 14,19 x 106
IU/mg. 4. ... Đ
ã xác định đƣợc độ sạch của sản phẩm IL-2 là 99,3% và đánh giá đƣợc hàm lƣợng nội độc tố của IL-2 nhỏ hơn 0,25 EU/ml, đáp ứng tiêu chuẩn về độ sạch và độ an toàn của sản phẩm tiêm sử dụng trong điều trị ung thƣ.
Kiến nghị
Từ những kết quả đạt đƣợc tôi xin đƣa ra một số kiến nghị sau:
1. ... X ây dựng công thức bán thành phẩm để pha chế IL-2 dạng thƣơng phẩm
2. ... K iểm tra các tiêu chí an toàn của sản phẩm IL-2 trên tế bào động vật nhƣ trên chuột và thỏ.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1. Anh LTL, Anh LPH, Khoa ĐT, Hong LTT, Nguyet PT, Thuy ĐT, Chien LA, & Hai TN. (2013). "Nghiên cứu tối ƣu sự biểu hiện gen mã hóa Interleukin-2 trong Escherichia coli.", pp.19–23.
2. Đặng Trần Hoàng, Đức, V. M., Phùng Thu Nguyệt, & Trƣơng Nam Hải. (2005). "Biểu hiện gen Interleukin-2 của ngƣời bị đột biến tại các điểm glycosyl hóa và gốc cystein 125 trong Escherichia coli", 3(2), pp.149–154.
3. Đỗ Thị Thảo, Đỗ Thị Phƣơng, Vũ Minh Đức, Đặng Trần Hoàng, & Trƣơng Nam Hải. (2007). "Xác định hoạt tính sinh học của interleukin-2 tái tổ hợp bằng phép thử sinh học trên tế bào CTLL2", 5(2), pp.157–161.
Tiếng Anh
4. Asgarpanah J. (2010). "Bioassay Methods useful to select the natural product cancer chemopreventive agents". Iranian Journal of Pharmaceutical Research, 0(0), pp.71– 71.
5. Bhagwat A. S., Sohail A., & Roberts R. J. (1986). "Cloning and characterization of the dcm locus of Escherichia coli K-12.". Journal of Bacteriology, 166(3), pp.751– 755.
6. Boyman O., & Sprent J. (2012). "The role of interleukin-2 during homeostasis and activation of the immune system". Nature Reviews Immunology, 12(3), pp.180– 190.
7. Caligiuri M. A., Murray C., Robertson M. J., Wang E., Cochran K., Cameron C., Schow P., Ross M. E., Klumpp T. R., & Soiffer R. J. (1993). "Selective modulation of human natural killer cells in vivo after prolonged infusion of low dose recombinant interleukin 2". The Journal of Clinical Investigation, 91(1), pp.123– 132.
8. Chu M. B., Fesler M. J., Armbrecht E. S., Fosko S. W., Hsueh E., Richart J. M., Chu M. B., Fesler M. J., Armbrecht E. S., Fosko S. W., Hsueh E., & Richart J. M. (2013). "High-Dose Interleukin-2 (HD IL-2) Therapy Should Be Considered for
Treatment of Patients with Melanoma Brain Metastases, High-Dose Interleukin-2 (HD IL-2) Therapy Should Be Considered for Treatment of Patients with Melanoma Brain Metastases". Chemotherapy Research and Practice, Chemotherapy Research and Practice, 2013, 2013, pp.e726925.
9. Cockshott A. R., & Bogle I. D. L. (1999). "Modelling the effects of glucose feeding on a recombinant E. coli fermentation". Bioprocess Engineering, 20(1), pp.83–90. 10. Devos R., Plaetinck G., Cheroutre H., Simons G., Degrave W., Tavernier J.,
Remaut E., & Fiers W. (1983). "Molecular cloning of human interleukin 2 cDNA