3.3.1. Mẫu vật nghiên cứu
- Các mẫu cà chua bị bệnh héo vàng để phân lập nấm F. oxysprum.
- Các mẫu đất thu thập được ở đồng ruộng trồng cà chua để phân lập vi sinh vật đối kháng.
3.3.2. Vật liệu nghiên cứu trong phòng thí nghiệm
- Dụng cụ và hóa chất thí nghiệm: Đĩa Petri, ống đong, cốc thủy tinh, bình tam
giác, que cấy, panh, dao, kéo, đèn huỳnh quang, tủ lạnh, tủ sấy, nồi hấp, tủ định ôn, kính hiển vi, kính lúp soi nổi, thiết bị đo nhiệt độ, ẩm độ, máy PCR, máy soi gel, máy ly tâm, các hóa chất giám định sinh học phân tử.
- Các loại môi trường phục vụ cho phân lập, nuôi cấy vi sinh vật
Môi trường PCA (Khoai tây: 20g; cà rốt: 20g; agar: 20g; nước cất: 1l);
Môi trường PPA (Agar: 20g; Peptone: 15g; KH2PO4: 1g MgSO4.7H2O: 0,5g; Terrachlor: 1g, chứa PCNB 75%, bổ sung Streptomycin 1g + Neomycin 0,12g; nước cất: 1l).
Môi trường 1/4 PDA (Khoai tây: 50g; destroze 5g; agar: 20g, bổ xung Streptomycin 0,16g + Neomycin 0,06; nước cất: 1l).
Môi trường WA (nước cất: 1l, agar: 20g).
Môi trường King’s B (peptone: 20g; Glyceron: 10ml; KH2PO4: 1,5g MgSO4.7H2O: 2,5g; Agar: 15g; nước cất: 1l).
Môi trường Gauze ((Tinh bột tan 20 g; K2HPO4 0,5 g; MgSO4. 7 H2O: 0,5 g: KNO3:1,0 g; NaCl: 0,5 g; FeSO4 0,1 g; Nước cất 1l).
3.3.3. Vật liệu nghiên cứu trong nhà lưới
- Chậu vại, xô nhựa, bình phun tay có dung tích 500; 1000 ml, máy tạo ẩm độ, cây con và các nguồn vi sinh vật phân lập và bảo quản trong phòng thí nghiệm.
3.4. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Thu thập và phân lập nguồn nấm Fusarium gây bệnh héo vàng cà chua, nguồn VSV (nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn) đối kháng tại các tỉnh Hà nội và phụ cận.
Chẩn đoán và giám định VSV đối kháng theo đặc điểm hình thái học
Nghiên cứu đánh giá khả năng đối kháng của các VSV với nấm F.
oxysporum gây bệnh héo vàng cà chua trong điều kiện phòng thí nghiệm và
nhà lưới.
Nghiên cứu các đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các dòng VSV đối kháng.
Chẩn đoán và giám định VSV có khả năng đối kháng cao bằng phương pháp sinh học phân tử.
Xác định mức độ an toàn sinh học của các VSV đối kháng với môi trường.
3.5. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1. Điều tra, thu thập nguồn nấm Fusarium gây bệnh, nguồn vi sinh vật đối kháng đối kháng
Phương pháp điều tra, thu thập theo “Phương pháp nghiên cứu BVTV” quyển I, quyển III của Viện Bảo vệ thực vật năm 1997 và 2000.
- Phương pháp điều tra: mỗi vùng trồng cà chua chọn 3 vườn đại diện, mỗi vườn điều tra 10 điểm theo hai đường chéo góc, mỗi điểm 10 cây.
- Phương pháp thu mẫu bệnh: Thu những mẫu bệnh mới xuất hiện triệu chứng điển hình, bảo quản trong bao giấy và túi ni lon. Các mẫu được bảo quản trongg tủ lạnh tại phòng thí nghiệm trước khi phân lập, giám định.
- Phương pháp thu mẫu đất: mẫu đất được thu thập tại vùng rễ những cây cà chua bị bệnh và không bị bệnh. Đất được thu ở tầng canh tác 10-20 cm, bảo quản trong túi ni lon.
3.5.2. Phương pháp phân lập nấm Fusarium gây bệnh héo vàng cà chua
Thân và rễ cà chua bị bệnh điển hình được thu thập, rửa dưới dòng nước chảy liên tục. Sau đó được khử trùng bằng cồn 70% trong 1 phút. Thấm khô
trên giấy thấm đã khử trùng hoặc hơ khô trên ngọn lửa đèn cồn. Dùng dao đã vô trùng cắt ngang thân thành những miếng cấy dày khoảng 2-3 mm tại điểm tiếp giáp giữa mô bệnh và mô khỏe. Các miếng thân, rễ này được cấy trên đĩa petri có môi trường 1/4PDA (Khoai tây: 62.5g; dextrose 5g; agar: 20g, bổ sung Streptomycin 0,16g + Neomycin 0,06). Sau khi cấy, úp ngược các đĩa petri để tránh đọng hơi nước trên bề mặt môi trường nuôi cấy và đặt trong tủ định ôn 28oC. Khi sợi nấm phát triển dài cách mô bệnh 1 - 2 cm, cấy truyền nấm (lấy sợi nấm tại rìa mép khuẩn lạc) sang các hộp petri có chứa môi trường dinh dưỡng PDA và bảo quản các hộp này trong tủ định ôn ở 28oC (Burgess L.W., 2009). Sau khi các mẫu cấy truyền phát triển thành các tản nấm, nấm gây bệnh được làm thuần bằng phương pháp cáy đơn bào tử.
Phương pháp cấy đơn bào tử: + Khử trùng que cấy
+ Tạo dung dịch bào tử: dùng que cấy lấy một lượng nhỏ sợi nấm trên mặt thạch có lẫn bào tử cho vào ống nghiệm chứa nước cất vô trùng (tùy lượng bào tử mà cho nhiều hay ít nước);
+ Đổ dịch bào tử vào một đĩa petri có chứa một lớp mỏng môi trường thạch nước cất;
+ Đổ dịch bào tử thừa đi, bào tử sẽ nằm lại trên mặt thạch; + Để dựng đĩa petri khoảng 18 giờ cho đến khi bào tử nảy mầm; + Kiểm tra đĩa petri dưới kính lúp soi nổi với nguồn sáng phía dưới;
+ Dùng một que cấy dẹp đã khử trùng cắt lấy ra một bào tử nảy mầm và chuyển sang một đĩa môi trường mới;
+ Bảo quản các hộp petri trong tủ định ôn ở điều kiện 280C và nấm Fusarium sẽ được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
Phương pháp phân lập nấm F. oxysporum từ đất
Đất được thu thập tại các vùng rễ cây bị bệnh, để khô ở điều kiện phòng, nghiền nhỏ và mịn. Cho 10g mẫu đất vào bình tam giác và cho thêm đến 100ml nước cất đã khử trùng (121oC trong 25 phút) tạo dung dịch A có nồng độ 10-1. Lắc dung dịch đất trên máy lắc trong 30 phút. Chuyển 10ml dung dịch A sang bình tam giác có chứa 90ml nước cất đã khử trùng có dung dịch B nồng độ 10-2. Tiếp tục làm các bước như trên để có dung dịch có nồng độ 10-3 hay 10-4. Dùng
pipet hút 0,5 ml dung dịch đất trang đều trên bề mặt đĩa petri có môi trường PDA. Đặt các đĩa phân lập này trong tủ định ôn 28oC cho đến khi các tản nấm phát triển. Cấy truyền các tản nấm và làm thuần chúng bằng phương pháp tách đơn bào tử như trên.
3.5.3. Phương pháp lây bệnh nhân tạo
Nấm F. oxysporum được nhân nuôi thuần trên môi trường PDA ở nhiệt độ 280C. Sau 7 ngày dùng slide đã khử trùng cạo nhẹ trên bề mặt để thu sợi nấm. Dung dịch nấm được pha loãng tới nồng độ 1x104 bào tử/ml và được sử dụng là dịch lây nhiễm. Hạt cà chua được trồng trong khay nhựa. Khi cây được 3-4 lá thật thì nhổ nhẹ cây, rửa sạch bộ rễ và ngâm trong dung dịch lây nhiễm nêu trên trong 20 phút. Sau đó các cây lây nhiễm được trồng trong chậu nhựa có chứa 3 kg đất khử trùng. Rễ cây nhúng trong nước cất khử trùng được sử dụng là công thức đối chứng. Toàn bộ cây thí nghiệm được đặt trong nhà kính, tưới nước, bón phân và chăm sóc cây trong điều kiện nhiệt độ từ 25-280C. Điều tra đánh giá bệnh sau 10, 20 và 30 ngày sau lây bệnh nhân tạo. Sử dụng thang bệnh 4 cấp, trong đó (i) cấp 0: cây không bị bệnh, (ii) cấp 1: cây bị bệnh nhẹ, gân lá có màu vàng nhưng lá không biến vàng, (iii) cấp 2: cây bị bệnh trung bình, lá biến vàng, (iv) cấp 3: cây bị bệnh nặng, lá rụng và cây bị héo chết.
Chỉ tiêu theo dõi
Số cây bị bệnh Tỉ lệ bệnh (%) = x 100 Tổng số cây lây bệnh n1 + 2n2 + 3n3 Chỉ số bệnh (%) = x100 N x 3
Trong đó: n1, n2 và n3: Số cây bị bệnh tại từng cấp bệnh tương ứng N: tổng số cây điều tra
- Phương pháp tính mật độ bào tử
Rót 10ml nước cất khử trùng vào hộp petri có nấm F. oxysporum thuần được nhân nuôi sau 7 ngày trên môi trường dinh dưỡng PDA ở 280C. Dùng slide khử trùng cạo nhẹ bề mặt thạch và lọc dung dịch nấm qua màng lọc. Dùng pipet chuyển dung dịch nấm sang buồng đếm hồng cầu Neuvour. Mật độ bào tử /ml
được tính theo công thức: A = (n x 10)/4 x D. Trong đó: A : số bào tử / ml, n: Số bào tử trung bình trong 5 ô đếm, D: nồng độ pha loãng.
3.5.4. Phương pháp phân lập nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn trong đất
- Phương pháp thu mẫu đất:
Đất được lấy ở độ sâu 10 – 20 cm trên ruộng cà chua bệnh, tại vùng rễ những cây không bị bệnh. Mẫu đất được để ở nhiệt độ phòng trong 7 – 10 ngày, sau đó được rây qua rây kích thước mắt 0,5 mm, cho vào túi nilon để ở nhiệt độ phòng trước khi phân lập.
- Phương pháp phân lập nấm Trichoderma:
Đất được thu thập, để kho ở điều kiện phòng, nghiền nhỏ và mịn. Cho 10g mẫu đất vào bình tam giác có chứa 90ml nước cất đã khử trùng (121oC trong 25 phút) tạo dung dịch A có nồng độ 10-1. Lắc dung dịch đất trên máy lắc trong 30 phút. Chuyển 10ml dung dịch A sang bình tam giác có chứa 90ml nước cất đã khử trùng có dung dịch B nồng độ 10-2. Cứ tiếp tục làm các bước như trên để có dung dịch có nồng độ 10-3 hay 10-4. Dùng pipet hút 0,5 ml dung dịch đất trang đều trên bề mặt đĩa petri có môi trường PDA. Đặt các đĩa phân lập này trong tủ định ôn 28oC cho đến khi các tản nấm phát triển. Cấy truyền các tản nấm và làm thuần chúng bằng phương pháp tách đơn bào tử.
- Phương pháp phân lập vi khuẩn, xạ khuẩn đối kháng nấm F. oxysporum Theo phương pháp của Wen-Chuan Chung et al. (2011).
Các bước phân lập tương tự phân lập nấm Trichoderma sp, độ pha loãng khoảng 10-5 đến 10-7. Môi trường phân lập là SPA; YS; Gauze; NA; CGA. Các đĩa môi trường sau phân lập được đặt trong tủ định ôn ở 300C trong 20 ngày.
3.3.5. Phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của nấm có ích với nấm
Fusarium
* Trong phòng thí nghiệm
- Khả năng đối kháng của nấm có ích với nấm F. oxysporum bằng kháng sinh trực tiếp: nấm đối kháng và nấm gây bệnh được nuôi cấy trên môi trường PDA. Đặt các miếng nấm có ích và nấm F. oxysporum có đường kính 0,5cm cùng một lúc vào 2 điểm đối xứng qua đường kính đĩa petri. Các đĩa được đặt trong tủ định ôn, nhiệt độ 280C. Mỗi công thức thí nghiệm 5 lần nhắc lại (5 hộp petri). Đánh giá sự đối kháng sau 7-10 ngày nuôi cấy.
- Khả năng ức chế của nấm Trichoderma sp. đối với nấm F. oxysporum bằng chất kháng sinh bay hơi: úp 2 đĩa có đường kính bằng nhau cùng chứa môi trường PDA, một đĩa cấy nấm Trichoderma sp., đĩa kia cấy nấm nấm F.
oxysporum. Đối chứng là cặp petri cấy nấm F. oxysporum. Theo dõi khả năng ức
chế nấm gây bệnh bởi chất kháng sinh bay hơi do nấm Trichoderma sinh ra. - Đánh giá hiệu quả ức chế của nấm đối kháng có ích với nấm bệnh theo công thức:
(Dc – Dt)
Hiệu quả ức chế (%) = --- x 100 Dc
Trong đó: - Dt : đường kính tản nấm bệnh trong đĩa có nấm có ích. - Dc: đường kính tản nấm bệnh trong đĩa đối chứng. * Trong nhà lưới
Nấm có ích và nấm F. oxysporum được nuôi cấy như đã nêu ở phần trên. Sau 7 ngày các loài nấm này được thu hoạch và pha loãng ở nồng độ 109 bào tử/ml đối với nấm có ích và 104 bào tử đối với nấm F. oxysporum. Đất ngoài đồng ruộng được khử trùng và lây nhiễm với dung dịch nấm F. oxysporum với nồng độ 1x104 bào tử/g đất và được sử dụng là nguồn đất thí nghiệm. Hạt cà chua được trồng trong khay nhựa. Khi cây được 3-4 lá thật thì nhổ nhẹ cây, rửa sạch bộ rễ, nhúng trong dung dịch nấm nồng độ 1x109 bào tử/ml trong 20 phút. Sau đó các cây này được trồng trong chậu có chứa 2 kg đất thí nghiệm đã được lây nhiễm thêm dung dịch nấm có ích ở nồng độ 109 bào tử/g đất trước đó 3 tuần. Cây được tưới ẩm hàng ngày. Cây chỉ nhúng trong nước cất khử trùng và trồng trong chậu chỉ có dung dịch nấm F. oxysporum nồng độ 1x104 bào tử/ml và trong chậu không có bất cứ dung dịch nấm được sử dụng như công thức đối chứng cây bệnh và đối chứng cây khỏe. Thí nghiệm bao gồm 3 công thức, mỗi công thức 5 lần nhắc lại (5 chậu). Điều tra đánh giá bệnh sau 20, 30 và 40 ngày sau trồng.
3.5.6. Phương pháp đánh giá khả năng đối kháng của vi khuẩn, xạ khuẩn với nấm F. oxysporum với nấm F. oxysporum
Theo phương pháp của Wen-Chuan Chung et al. (2011) * Trong phòng thí nghiệm
Miếng khuẩn lạc (0,5mm) có nấm F. oxysporum được cấy truyền tại điểm giữa của hộp petri có môi trường PDA. Sau một ngày, các VSV đánh giá được cấy truyền đối xứng trong hộp petri. Các hộp petri không cấy truyền VSV là công thức đối chứng. Đặt các đĩa trong tủ định ôn ở nhiệt độ 280C. Quan sát các đĩa môi trường, nếu xuất hiện những vùng ức chế (vòng vô khuẩn), nghĩa là có sự đối kháng tại điểm đó. Dựa vào kích thước vòng ức chế (D - d, mm) để đánh giá hiệu lực đối kháng của chúng. Trong đó D là đường kính tản nấm F.
oxysporum ở công thức đối chứng, d là đường kính tản nấm F. oxysporum ở
công thức thí nghiệm. Mỗi công thức thí nghiệm 5 lần nhắc lại (5 hộp petri). Đánh giá sự đối kháng sau 7-10 ngày nuôi cấy.
Hiệu quả đối kháng:tính theo công thức
Trong đó: CT: Công thức thí nghiệm ĐC: đối chứng
- Kiểm tra tính kháng nấm: Lấy 1 cm3 vùng ức chế của xạ khuẩn, cấy truyền sang đĩa petri có chứa môi trường PDA, đặt trong tủ định ôn ở 260C trong 7 ngày. Theo dõi sự phát triển của nấm F. oxysporum, nếu nấm không phát triển lại, chứng tỏ VK, XK có khả năng kháng nấm hoàn toàn.
* Trong nhà lưới
Vi sinh vật đối kháng và nấm F. oxysporum được nuôi cấy như đã nêu ở phần trên. Sau 7-10 ngày, các VSV đối kháng và nấm Fusarium này được thu hoạch và pha loãng ở nồng độ 109 cfu/ml đối với VSV đối kháng và 104 bào tử/ml đối với nấm F. oxysporum. Dung dịch VSV đối kháng ở nồng độ 1x109 cfu/ml và nấm Fusarium 1x104 bào tử/ml được trộn đều trong chậu có chứa 3kg đất ruộng khử trùng (dung dịch nấm lây nhiễm trước dung dịch VSV đối kháng 1 ngày). Đất lây nhiễm được sử dụng là nguồn đất thí nghiệm. Sau 3 tuần, cây cà chua khỏe, giai đoạn 3-4 lá được trồng trong chậu đã nhiễm nấm Fusarium và VSV đối kháng. Cây được tưới ẩm hàng ngày. Cây chỉ nhúng trong nước cất khử trùng và trồng trong chậu chỉ có dung dịch nấm F. oxysporum nồng độ 1x104 bào tử/ml và trong chậu không xử lý dung dịch VSV được sử dụng như công thức đối
CT
Hiệu quả đối kháng (%) = ( 1 - ) x 100 ĐC
chứng cây bệnh và đối chứng cây khỏe. Thí nghiệm bao gồm 3 công thức, mỗi công thức 3 lần nhắc lại (21 cây/công thức). Điều tra tỉ lệ bệnh, chỉ số bệnh tại 20, 30 và 40 ngày sau trồng.
- Phương pháp nghiên cứu sự biến động số lượng VSV đối kháng trong nhà lưới
Công thức thí nghiệm:
- Công thức 1. Lây nhiễm nấm F.oxysporum nồng độ 1 x 104 bào tử/g đất sau đó tưới VK, XK đối kháng nồng độ 1 x 109 bào tử/g đất
- Công thức 2. Đối chứng (không lây nhiễm VSV đối kháng) Phương pháp:
Lấy mẫu đất sau khi trồng 10, 20 và 30 ngày và phân tích trong phòng thí nghiệm như phương pháp nêu trên. Các đĩa môi trường sau phân lập được đặt trong tủ định ôn ở 300C và đếm số lượng khuẩn lạc sau 20 ngày lây nhiễm.
3.5.7. Nghiên cứu các phản ứng sinh lý, sinh hóa của VSV đối kháng
- Các môi trường sử dụng trong phản ứng sinh lý, sinh hóa vi sinh vật đối kháng (xác định tính yếm khí; thử khả năng khử Nitrat; định khả năng đồng hóa nguồn các bon từ đường Glucose và Sacarose; xác định tính chịu muối (NaCl); định tính hoạt độ enzym chitinase, β-glucanase và cellulase...).
+ Môi trường chọn lọc để xác định tính yếm khí của các nguồn vi khuẩn và xạ khuẩn đối kháng: Peptone 2g; NaCl 5g; KH2PO4 0.3g; Agar 3g;