Phần 4 Kết quả nghiên cứu và thảo luận
4.4. Giám định vi sinh vật đối kháng
Để biết được chính xác hơn tên loài vi khuẩn VF7 và xạ khuẩn F123. Đề tài tiến hành giám định vi khuẩn và xạ khuẩn này bằng sinh học phân tử. Kết quả cho thấy vi khuẩn VF7 là loài Bacillus subtilis và xạ khuẩn F123 là loài
Streptomyces katrae ( Bảng 4.20). So sánh 2 loài này với danh mục an toàn sinh
học của vi sinh vật cho thấy cả 2 loài này đều thuộc nhóm an toàn cấp độ 1.
Bảng 4.20. Kết quả giám định vi khuẩn, xạ khuẩn đối kháng
Mẫu sequencing Phản ứng Kích thước sản phẩm sau khi lắp ráp (bp) Phần trăm đồng nhất trình tự Mã GenBank Loài VF-7 13B5ZAA016 13B5ZAA017 1442 99.86 CP000560 Bacillus subtilis F-123 13B5ZAA028 13B5ZAA029 1412 98.87 AB184189 Streptomyc es katrae 4.5. KHẢ NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA CÁC DÒNG VI KHUẨN, XẠ KHUẨN TRONG ĐIỀU KIỆN NHÀ LƯỚI
Không chỉ đánh giá sơ bộ trong phòng, để đánh giá hiệu quả của 10 dòng vi khuẩn, xạ khuẩn có triển vọng đối với nấm F.oxysporum gây bệnh héo vàng cà chua, chúng tôi tiến hành các thí nghiệm về khả năng đối kháng của 10 dòng vi khuẩn, xạ khuẩn đối với nấm F.oxysporum trong điều kiện nhà lươi.
4.5.1. Biến động quần thể của các dòng vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm F.
oxysporum trong điều kiện nhà lưới
Sau khi đã có kết quả trong phòng thí nghiệm, 7 dòng VK, 3 dòng XK có triển vọng được thử nghiệm khả năng đối kháng nấm F. oxysporum gây hại cà
chua trong nhà lưới. Cây cà chua giai đoạn 3-4 lá thật được trồng trong chậu đất có xử lý hỗn hợp dung dịch vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm F. oxysporum. Theo dõi sự biến động về quần thể của nấm F. oxysporum và VSV đối kháng trong đất, kết quả được trình bày trong Bảng 4.21 và 4.22.
Bảng 4.21. Biến động quần thể của các dòng vi khuẩn, xạ khuẩn đối kháng trong điều kiện nhà lưới
TT Công thức1 Mật độ cfu (x1010)/g đất2 10 NST3 20 NST 30NST 1 F-29.1 4,3 14,0 102 2 F-90.1 3,0 11,7 560 3 F-97.5 6,7 32,0 269 4 F-100.5 3,7 19,0 600 5 F-116 11 14,6 528 6 VF-6 3,7 11,7 420 7 VF-7 3,3 22,7 310 8 F-112 3,7 17,0 746 9 F-123 4,7 26,3 882 10 F-129 2,0 18,3 264 Ghi chú:
(1). Mật độ dung dịch vi khuẩn và xạ khuẩn xử lý trong đất trước khi trồng cây là 1 x 109 cfu/g đất (2). Mật độ cfu trong đất trồng cà chua
(3). Ngày sau trồng
Số liệu Bảng 4.21 và Bảng 4.22 cho thấy mật độ bào tử của các dòng vi khuẩn và xạ khuẩn tăng mạnh theo thời gian. Sau 30 ngày, mật độ bào tử của các dòng vi khuẩn có thể tăng từ 23,72 lần (dòng F-29.1.) đến 186,7 lần (dòng F-90.1), mật độ bào tử của các dòng xạ khuẩn cũng tăng từ 132 lần (dòng F-129) đến 201,6 lần (dòng F-112). Sự tăng mạnh số lượng bào tử trong đất cùng với khả năng ức chế đã hạn chế sự gia tăng quần thể của các dòng nấm gây hại cà chua. Sau 30 ngày mật độ bào tử của nấm Fusarium giảm đáng kể trong đất trồng cà chua có xử lý các dòng vi khuẩn xạ khuẩn. Mật độ bào tử nấm F. oxysporum trong đất trồng cà chua có thể giảm từ 33,75 lần (công thức xử lý dung dịch xạ khuẩn dòng F-123) đến 215 lần (công thức xử lý dung dịch vi khuẩn dòng F-90.1).
Bảng 4.22. Biến động mật độ bào tử nấm gây bệnh trong đất khi sử dụng các vi sinh vật trong điều kiện nhà lưới
TT Công thức1 Mật độ bào tử nấm F. oxysporum (x103)/g đất2 10 NST3 20 NST 30NST 1 F-29.1 7,0 4,0 0,06 2 F-90.1 4,3 4,0 0,02 3 F-97.5 8,0 1,7 0,13 4 F-100.5 7,0 2,3 0,08 5 F-116 4,0 2,7 0,27 6 VF-6 6,0 4,3 0,03 7 VF-7 3,7 2,0 0,02 8 F-112 2,3 2,0 0,04 9 F-123 2,7 1,3 0,08 10 F-129 4,3 1,0 0,05 Ghi chú:
(1). Mật độ dung dịch nấm vi khuẩn và xạ khuẩn xử lý trong đất trước khi trồng cây là 1 x 109 cfu/g đất (2). Mật độ bào tử nấm F.oxysporum xử lý trong đất là 1 x 104 trước khi trồng cà chua
(3). Ngày sau trồng.
4.5.2. Hiệu quả ức chế của các dòng vi khuẩn và xạ khuẩn có triển vọng đối với bệnh héo vàng cà chua trong nhà lưới với bệnh héo vàng cà chua trong nhà lưới
Ngoài việc đánh giá sự biến động quần thể của VK, XK và nấm bệnh F.
oxysporum trong điều kiện nhà lưới, thì hiệu quả giảm bệnh héo vàng cũng là chỉ
tiêu đánh giá tính đối kháng của các dòng VK, XK này, kết quả thí ngiệm trình bày ở Bảng 4.23.
Bảng 4.23. Hiệu quả của các dòng vi khuẩn và xạ khuẩn đối kháng có triển vọng với bệnh héo vàng cà chua trong nhà lưới
TT Công thức Tỷ lệ cây bị bệnh (%) HQGB (%) sau 40 ngày 20 NST 30 NST 40 NST 1 Đối chứng1 0,0 0,0 a 0,0 a - 2 F-29.1 0,0 9,52 abc 25,39cd 60,0 3 F-90.1 0,0 11,10 bc 25,39cd 60,0 4 F-97.5 0,0 9,52 abc 23,81bc 62,5 5 F-100.5 0,0 7,93 ab 22,22 ab 65,0 6 F-116 0,0 9,52abc 23,81bc 62,5 7 VF-6 0,0 11,10bc 25,39 cd 60,0 8 VF-7 0,0 6,35a 20,64 a 67,5 9 F-112 0,0 12,69 c 27,06 d 57,4 10 F-123 0,0 7,93 ab 20,64 a 67,5 11 F-129 0,0 11,10 bc 25,39 cd 60,0 12 Đối chứng 22 9,52 20,61 d 63,49e - LSD 0.05 4,43 3,15 CV(%) 23,5 19,8 Ghi chú:
(1). Cà chua trồng trong đất không có dung dịch nấm và vi khuẩn, xạ khuẩn (1x109 cfu/g) (2). Cà chua trồng trong đất chỉ xử lý dung dịch nấm dòng F. oxyspoum (1x104 bào tử/g đất)
(3). Các giá trị trong cùng một cột biểu thị bằng các chữ giống nhau sai khác không có ý nghĩa ở xác suất P < 0,5 theo phân tích Duncan’s.
Kết quả bảng 4.23 cho thấy, cả 7 dòng vi khuẩn và 3 dòng xạ khuẩn có triển vọng đều có khả năng ức chế nấm F. oxysporum gây bệnh héo vàng cà chua trong điều kiện nhà lưới, hiệu quả giảm bệnh sau 30 ngày đạt từ 57,4 đến 67,5%. Các dòng có triển vọng nhất là VF-7, F-123 khi chúng có thể hạn chế đến 67,5% sự gây hại của nấm F. oxysporum.
Từ các kết quả nghiên cứu về khả năng đối kháng của các dòng VK, XK triển vọng trong điều kiện phòng thí nghiệm và trong nhà lưới, dòng vi khuẩn VF-7 và dòng xạ khuẩn F-123 là hai dòng có khả năng đối kháng mạnh nhất với
nấm F.oxysporum, sẽ được lựa chọn để sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ
PHẦN 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
5.1. KẾT LUẬN
- Kết quả phân lập được 57/80 mẫu cây cà chua bị bệnh và mẫu đất trồng cà chua có xuất hiện nấm Fusarium oxysporum, chiếm tỉ lệ 71,25%.
- Phân lập được 3 dòng nấm Trichoderma có hiệu quả đối kháng nấm
F.oxysporum từ 70 – 78,9% ở điều kiện trong phòng thí nghiệm. Tuy nhiên cả hai
dòng nấm này đều có khả năng ức chế nấm F. oxysporum thấp hơn dòng nấm có
sẵn T. harzianum đang được lưu giữ tại Bộ môn Bệnh cây - Viện Bảo vệ thực vật.
- Xác định được 10 dòng VK, XK có khả năng đối kháng cao với nấm F.
oxysporum gây bệnh héo vàng cà chua. Hiệu quả dao động từ 78,41 đến 86,59%
ở điều kiện phòng thí nghiệm. Trong điều kiện nhà lưới hiệu lực phòng trừ bệnh từ 57,4 đến 67,5%. Trong đó hai dòng có hiệu quả cao nhất là dòng vi khuẩn ký hiệu VF-7 và dòng xạ khuẩn ký hiệu F-113.
- Môi trường dinh dưỡng PDA và SPA phù hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của 10 dòng VK, XK. Chúng thích hợp nhất với độ pH từ 7-8 và nhiệt độ là 300C. Các dòng vi khuẩn và xạ khuẩn đều thuộc nhóm kỵ khí, có khả năng đồng hóa nguồn các bon từ các loại đường, thủy phân tinh bột, hoạt hóa các enzym cellulase, chitinase, β-glucanase và chịu mặn kém.
- Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử đã giám định được dòng vi khuẩn ký hiệu VF-7 là loài Bacillus subtilis và dòng xạ khuẩn ký hiệu F-123 là loài
Streptomyces katrae. Cả 2 loài này đều thuộc nhóm an toàn cấp độ 1 trong danh
mục an toàn sinh học của vi sinh vật.
5.2. KIẾN NGHỊ
- Tiếp tục nghiên cứu khả năng nhân sinh khối, khả năng đối kháng, của các dòng vi khuẩn, xạ khuẩn đối kháng ngoài đồng ruộng để có thể ứng dụng là tác nhân sinh học để sản xuất chế phẩm sinh học phòng trừ bệnh héo vàng cà chua trong sản xuất.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt:
1. Bùi Thị Việt Hà (2006). Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam. Luận án tiến sĩ sinh học. Đại học Khoa học tự nhiên. Đại học quốc gia Hà Nội. tr. 3 - 48; 54 – 64.
2. Burgess L.W., Knight T.E., Tesoriero L. và Phan H.T ( 2009). Cẩm nang chẩn đoán bệnh cây ở Việt Nam. Chuyên khảo ACIAR số 129a, 210 pp. ACIAR: Canberra. 3. Dương Minh, Lê Lâm Cường, Phạm Văn Kim, Vandermissen E và Coosemans J.
(2003). Khả năng đối kháng của các chủng nấm Trichoderma spp. nội địa đối với bệnh thối rễ cam quít do nấm Fusarium solani tại đồng bằng sông Cửu long. Tạp chí khoa học Đại học Cần thơ (chuyên ngành bảo vệ thực vật).
4. Ngô Bích Hảo, Vũ Duy Nam và Trần Đình Quí (2006). Khảo sát hiệu lực đối kháng của nấm Trichoderma spp phòng trừ bệnh héo rũ gốc mốc trắng Sclerotium rolfsii
hại lạc. Tạp chí Bảo vệ thực vật. (1).
5. Ngô Đình Quang Bính ( 2005). Vi sinh vật học công nghiệp. Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật. Trung tâm khoa học Tự nhiên và công nghệ Quốc gia, Hà Nội. tr. 53 - 71.
6. Nguyễn Đức Lượng (2004). Công nghệ vi sinh vật tập 1. NXB ĐH Quốc Gia TP Hồ Chí Minh, TPHCM.
7. Nguyễn Lân Dũng ( 2002). Tuyển tập Vi sinh vật học. Nhà xuất bản Đai học Quốc gia Hà Nội, Hà Nội.
8. Nguyễn Ngọc Anh Thư, Phan Thanh Trí, Bùi Thị Thanh Thuý và Nguyễn Văn Hoà (2005). Kết quả nghiên cứu bệnh vàng lá thối rễ trên cây có múi và biện pháp phòng trừ. Báo cáo Khoa học, Viện NCCAQ miền Nam.
9. Nguyễn Thị Kim Cúc; Phạm Việt Cường và Nguyễn Thị Tuyết Mai (2000). Một số tính chất của vi khuẩn phân huỷ methyl parathion phân lập từ các mẫu đất tại Hà Nội. Hội nghị sinh học quốc gia: Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong sinh học. tr. 29-34.
10. Nguyễn Văn Tuất và Lê Văn Thuyết (2001). Sản xuất chế biến và sử dụng thuốc bảo vệ thực vật thảo mộc và sinh học. Nhà xuất bản nông nghiệp, Hà Nội. 56tr. 11. Phạm Ngọc Dung, Ngô Vĩnh Viễn, Nguyễn Văn Tuất, Nguyễn Thị Ly, Trần Ngọc
Khánh, Hồ Gấm và Nguyễn Quang Tuấn (2008). Một số kết quả phòng trừ bệnh chết nhanh gây hại hồ tiêu tại Đăk Nông Tạp chí Bảo vệ thực vật, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn. ISSN: 0868-2801. (3).
12. Trần Thị Thuần, Nguyễn Thị Ly và Phạm Ngọc Dung ( 2004). Nghiên cứu và sử dụng nấm đối kháng Trichoderma để phòng trừ nhóm nấm tồn tại trong đất gây hại cây trồng. Tạp chí bảo vệ thực vật.
13. Viện Bảo vệ thực vật (1997). Phương pháp nghiên cứu Bảo vệ thực vật. Tập 1 Phương pháp điều tra cơ bản dịch hại nông nghiệp và thiên địch của chúng. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.
14. Vũ Triệu Mân và Lê Lương Tề ( 2001). Giáo trình bệnh cây nông nghiệp. NXB Nông nghiệp, Hà Nội.
Tiếng Anh:
15. Agrios,G.N. (1997). Plant Pathology,4thEd.Academic Press,San Diego, CA, USA. 16. Alvarez F., Castro M., Prı´ncipe A., Borioli G., Fischer S., Mori G. and Jofre E.
(2011). The plant-associated Bacillus amyloliquefaciens strains MEP218 and ARP23 capable of producing the cyclic lipopeptides iturin or surfactin and fengycin are effective in biocontrol of sclerotinia stem rot disease. Journal of Applied Microbiology. Vol. 112, Issue 1. DOI: 10.1111/j.1365672.2011.05182.
17. Berg G, Kurze S, Buchner A, Wellington EM and Smalla K. (2000). Successful strategy for the selection of new strawberry-associated rhizobacteria antagonistic to verticillium wilt. Can J Microbiol 46:11281137.
18. Bernard R. Glick and Yoav Bashan (1997). Genetic manipulation f plant growth- promoting bacteria to enhance biocontrol of phytopathogens. Biotechnology Advances. Vol. 15, Issue 2. pp. 353–378. doi:10.1016/S0734-9750(97)00004-9. 19. Biswas, K.K. and Das N.D., (1999). Biological control of pigeon pea wilt caused
by Fusarium udum with Trichoderma spp. Annals of Plant Protection Sciences. Vol 7 (1). pp. 46-50.
20. Booth C. (1997). The genas Fusarium, Common wealth. Mycological institule, keww, serrey, England.
21. Burgess L. W. Backhouse and summerll (1995). Biology and contral of diseases caused by soiborne, Fungal pathogens.
22. Burgess L. W., Nelson. P.E and Summerll. B.A (1998). Variability and stability of mophologial characters in Fusarium oxysporum, Mycologia.
23. Burgess L.W., Nelson. P.E and Summerll.Bullock. (1994). Laboratory Manual of Fusarium bred. Edition University of Sydney, Australia.
24. Chet, I. and Baker, R. (1980). Induction of suppressiveness of Rhizoctonia solanii in soil. Phytopathology. Vol 70. pp. 994-998.
25. Diby, P. and Sarma, Y.R.( 2006). “Antagonistic effects of metabolites of Pseudomonas fluorescens strains on the different growth phases of Phytophthora capsici, foot rot pathogen of black pepper (Piper nigrum L.)”, Arch. Phytopathol. 26. Doyle, J.J.; Doyle, J.L (1987). A rapid DNA isolation procedure for small
quantities of fresh leaf tissue. Phytochemical Bulletin, Vol 19. pp.11-15; 1987. 27. Dubey SC, Sureshm and Singh (2007). Evaluation of Trichoderma species against
Fusarium oxysporum f.sp. ciceris for integrated management of chickpea wilt.Biological Control. Vol 40. pp. 118-127.
28. Erwin D.C. and Ribeiro O.K, (1996). Phytopthora disease wordwide. American Phytopathological Society Press: St. Paul,Minnesota.
29. Haiyan Li, Marcos A. Soares, Mónica S. Torres, Marshall Bergen and James F. White Jr. (2015). Endophytic bacterium, Bacillus amyloliquefaciens, enhances ornamental hosta resistance to diseases and insect pests. Journal of Plant Interactions.
30. Han Qiao Hu, Xin Shen Li and Hong He (2010). Characterization of an antimicrobial material from a newly isolated Bacillus amyloliquefaciens from mangrove for biocontrol of Capsicum bacterial wilt. Biological Control. Vol. 54, Issue 3. pp. 359–365.doi:10.1016/j.biocontrol.2010.06.015.
31. Herrera, C. M. (1993) Selection on complexity of corolla outline in a hawkmoth pollinated violet. Evolutionary Trends in Plants. pp. 9-13.
32. Hoflich, G., Wiehe, W. and Kühn, G. ( 1994). Plant growth stimulation with symbiotic and associative rhizoshpere microorganisms. Experientia. pp. 897-905. 33. Gabriele Berg, Nicolle Roskot, Anette Steidle, Leo Eberl, Angela Zock and
Kornelia Smalla ( 2002). Plant-Dependent Genotypic and Phenotypic Diversity of Antagonistic Rhizobacteria Isolated from Different Verticillium Host Plants. Appl. Environ. Microbiol. Vol. 68 (7). pp. 3328-3338.
34. Glick BR (1995). The enhancement of plant growth by free-living bacteria. Can J Microbiol. pp. 109–117.
35. Jensen, G.B., Larsen, P., Jacobsen, B.L., Madsen, B., Smidt, L., and Andrup, L. (2002) Bacillus thuringiensis in fecal samples from greenhouse workers after exposure to B. thuringiensis-based pesticides. Appl Environ Microbiol. Vol. 68. pp. 4900–4905.
36. Jollès P. Muzzarelli RAA (1999) Chitin and chitinases ( Eds). Birkhauser Verlag, Basel. ISBN 3 – 7643-5815-7.
37. Kui J. L, Seralathan K. K., Han S. S., Cho K. S., Gun W. L. (2008). Biological control of Phytophthora blight in red pepper (Capsicum annuum L.) using Bacillus subtilis World J Microbiol Biotechnol. Vol 24. pp. 1139–1145.
38. Kyung Seok Park, Paul Diby, Kim Yong Ki, Nam Ki Woong, Lee Yong Kee, Choi Hyo Won and Lee Sang Yeob (2008), Induced systemic Resistance by Bacillus vallismortis EXTN-1 suppressed bacterial wilt in tomato caused by Ralstonia solanacearum, The Korean Society of Plant Pathology, Plant Pathology, J.23. (1). 39. Landa B.B., Herves A., Bettiol W. and Jimenez-Diaz R.M. (1997). Antagonistic
activity of bacteria from chickpea rhizosphere against Fusarium oxysporum f. sp. ciceris. Phytoparasitica. Vol 25 (4). pp. 305–318.
40. Lemanceau, P., Bakker, P. A. H. M., Kogel, W. J., Alabouvette, C., and Schippers, B. (1993). Antagonistic Effect of Nonpathogenic Fusarium oxysporum Fo47 and Pseudobactin 358 upon Pathogenic Fusarium oxysporum f. sp. dianthi. Appl. Environ. Microbiol.
41. Müller H, Westendorf C, Leitner E, Chernin L, Riedel K, Schmidt S, Eberl L and Berg G.( 2009). Quorum-sensing effects in the antagonistic rhizosphere bacterium Serratia plymuthica HRO-C48. FEMS Microbiol Ecol. Vol 67(3). pp. 468-78. 42. Natarajan, M., Kannaiyan, J., Willey, R. W. and Nene and Y. L. (1985). Study on
the effect of cropping system on Fusarium wilt of pigeonpea. Field Crop Res. 43. Nelson. P.E., L.W. Burgess and B.A. Summerell (1990). Some morphological and
physiological characters of Fusarium species in section Liseola and Elegans and similar species. Mycologia. Vol 82. pp. 99-106.
44. Nielsen, M. N., Sørensen, J., Fels, J. & Pedersen and H. C. (1998). Secondary metabolite- and endochitinase-dependent antagonism toward plant-pathogenic microfungi of Pseudomonas fluorescens isolates from sugar beet rhizosphere. Appl Environ Microbiol. Vol 64. pp. 3563–3569.
45. Nielsen, T.H., Sorensen, D., Tobiasen, C., Andersen, J.B., Christophersen, C., Giskov, M. and Sorensen, J. (2002). “Antibiotic and biosurfactant properties of cyclic lipopeptides produced by fluorescent Pseudomonas spp. from the sugar beet rhizopshere”, Appl Envrion Microbiol. Vol 68. pp. 3416 - 3423.
46. Posada F and Vega FE (2005). Establishment of the fungal entomopathogen