Phần 4 Kết quả nghiên cứu và thảo luận
4.3. Đặc điểm sinh học, sinh lý và sinh hóa của các dòng vi khuẩn, xạ khuẩn
4.3.4. Đặc tính sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn và xạ khuẩn có triển vọng
4.3.4.1. Xác định tính yếm khí
Ôxy có vai trò hết sức quan trọng trong hoạt động sống của vi sinh vật. Tuy nhiên mỗi loại vi sinh vật lại có nhu cầu sử dụng ô xy khác nhau. Tùy từng trường hợp đó mà chúng ta sử dụng phương pháp nuôi cấy khác nhau. Trên cở đó chúng tôi tiến hành xác định đặc tính yếm khí của 10 dòng vi khuẩn, xạ khuẩn bằng cách quan sát sự thay đổi màu trong môi trường của các ống nghiệm. Kết quả được trình bầy ở Bảng 4.12.
Bảng 4.12. Đặc tính yếm khí của các dòng VK, XK triển vọng
TT Ký hiệu nguồn VK, XK Tính yếm khí Phản ứng chuyển màu 1 F-29.1 VK + Xanh sang vàng 2 F-90.1 VK + Xanh sang vàng 3 F-97.5 VK + Xanh sang vàng 4 F-100.5 VK + Xanh sang vàng 5 F-116 VK + Xanh sang vàng 6 VF-6 VK + Xanh sang vàng 7 VF-7 VK + Xanh sang vàng 8 F-112 XK + Xanh sang vàng 9 F-123 XK + Xanh sang vàng
10 F-129 XK - Không chuyển màu
Trong số 10 dòng VK, XK có triển vọng đối kháng, chỉ có một dòng F- 129 là không có phản ứng chuyển màu, tức là xạ khuẩn này thuộc nhóm hiếu khí bắt buộc. Dịch cấy các dòng còn lại đều chuyển màu, như vậy 9 dòng còn lại thuộc nhóm kỵ khí không bắt buộc, có khả năng sinh trưởng, phát triển trong điều kiện có không khí và không có không khí.
Hình 4.8. Tính yếm khí của một số dòng vi khuẩn và xạ khuẩn
4.3.4.2. Xác định khả năng khử nitrat
Mỗi loại vi sinh vật đều có một quá trình chuyển hoá riêng. Để xếp loại vi sinh vật, chúng ta phải xác định tính chất sinh vật hoá học của chúng. Tìm khả năng khử nitrat thành nitrit của vi sinh vật là một trong các chỉ tiêu quan trọng trong việc xác định và phân biệt các nhóm vi sinh vật. Vì vậy chúng tôi đã tiến hành xác định khả năng khử nitrat của 10 dòng vi khuẩn, xạ khuẩn. Kết quả như sau:
Bảng 4.13. Khả năng khử nitrat của các dòng vi khuẩn và xạ khuẩn có triển vọng
TT Ký hiệu nguồn VK, XK Khả năng khử Nitrat
1 F-29.1 VK + 2 F-90.1 VK + 3 F-97.5 VK + 4 F-100.5 VK + 5 F-116 VK + 6 VF-6 VK + 7 VF-7 VK + 8 F-112 XK + 9 F-123 XK + 10 F-129 XK +
Kết quả thí nghiệm cho thấy cả 10 nguồn vi khuẩn, xạ khuẩn đều có khả năng khử nitrat.
Hình 4.9. Khả năng khử nitrat của một số dòng vi khuẩn, xạ khuẩn
4.3.4.3. Khả năng đồng hóa nguồn cacbon
Căn cứ vào nguồn thức ăn cacbon người ta chia sinh vật thành các nhóm sinh lý tự dưỡng và dị dưỡng. Tuỳ nhóm vi sinh vật mà nguồn cacbon được cung cấp có thể là các chất vô cơ hoặc chất hữu cơ. Khả năng hấp thụ các nguồn thức ăn khác nhau phụ thuộc vào hai yếu tố: một là thành phần hoá học và tính chất sinh lý của nguồn thức ăn này, hai là đặc điểm sinh lý của từng loại vi sinh vật Dựa vào đặc điểm này để sử dụng nguồn cacbon thích hợp cho từng loại vi sinh vật trong quá trình nhân nuôi chúng. Thí nghiệm khả năng đồng hóa nguồn cacbon của 10 dòng vi khuẩn, xạ khuẩn chúng tôi thu được kết quả sau:
Bảng 4.14. Khả năng đồng hóa nguồn cacbon của các nguồn vi khuẩn, xạ khuẩn có triển vọng
TT Ký hiệu
nguồn VK, XK
Nguồn cac bon
Glucose Saccarose Tinh bột Manitol
1 F-29.1 VK + + - + 2 F-90.1 VK + + - + 3 F-97.5 VK + + - + 4 F-100.5 VK + + + + 5 F-116 VK + + + + 6 VF-6 VK + + + + 7 VF-7 VK + + - + 8 F-112 XK + - - - 9 F-123 XK + - - - 10 F-129 XK + - - -
Trong số các nguồn cacbon sử dụng làm thí nghiệm, cả 10 dòng vi khuẩn và xạ khuẩn đều có khả năng đồng hóa đường glucose. 8 dòng có khả năng đồng hóa đường saccarose. Trong khi đó 2 dòng F-112 và F-129 không có khả năng đồng hóa đường saccarose. Với tinh bột, chỉ có 3 dòng là F-100.5; F-116 và VF-6 là có khả năng đồng hóa. Có 7 dòng có khả năng đồng hóa rượu manitol, 3 dòng không có khả năng đồng hóa rượu manitol là F-112, F-123 và F-129 (Bảng 4.14).
Hình 4.10. Nguồn cacbon
từ Glucose Hình 4.11. Nguồn cacbon từ Saccarose
Hình 4.12. Nguồn cacbon từ Manitol từ Manitol
Hình 4.13. Nguồn cacbon từ tinh bột tan từ tinh bột tan
4.3.4.4. Tính chịu muối (NaCl) của các dòng vi khuẩn, xạ khuẩn triển vọng
Bảng 4.15. Ảnh hưởng của nồng độ muối đến sinh trưởng, phát triển của các dòng vi khuẩn, xạ khuẩn có triển vọng
Công thức
Số khuẩn lạc VK, XK sau 7 ngày nuôi cấy
Vi khuẩn Xạ khuẩn F29.1 F90.1 F97.5 F100.5 F116 VF6 VF7 F112 F123 F129 NaCl 1% 170,43e 21,90d 45,00e 117,00e 39,0c 55,8c 33,13d 87,90c 66,33c 137,87c NaCl 3% 40,90c 14,90c 33,10c 34,43c 34,47b 44,43b 22,13b 78,13b 53,67b 124,90b NaCl 5% 21,00b 8,50b 21,53b 9,80b 0,0a 0,0a 0,0a 0,0a 0,0a 0,0a NaCl 7% 0,0a 0,0a 0,0a 0,0a 0,0a 0,0a 0,0a 0,0a 0,0a 0,0a ĐC 68,10d 15,47c 41,43d 61,00d 36,33b 45,33b 24,9c 113,67d 78,10d 187,43d LSD 0.05 3,98 1,88 3,14 2,44 2,62 3,04 2,47 5,83 6,03 4,7 CV(%) 3,6 8,5 6,1 3,0 6,6 5,7 8,5 5,7 8,4 2,9 Số liệu Bảng 4.15 cho thấy cả 10 dòng vi khuẩn, xạ khuẩn đối kháng có triển vọng đều không phát triển được ở nồng độ NaCl 5% và 7%, chỉ có 4 dòng vi khuẩn F-29.1, F-90.1, F-97.1 và F-100.5là có khả năng phát triển ở nồng độ 5%. 3 dòng xạ khuẩn đối kháng không có khả năng chịu mặn, số khuẩn lạc ở công thức đối chứng nhiều hơn ở các công thức có NaCl. 7 dòng vi khuẩn triển vọng lại thích hợp với nồng độ muối 1%, số khuẩn lạc vi khuẩn ở công thức này cao hơn nhiều (sai khác có ý nghĩa) so với công thức đối chứng và giảm dần khi nồng độ muối tăng lên ở mức 3%và 5%. Các dòng VF-6. VF-7 và F-116 không phát triển ở nồng độ muối 5%.
4.3.
4.3.4.5. Định tính hoạt độ enzyme của các dòng vi khuẩn, xạ khuẩn triền vọng
Cellulose là chất hữu cơ khó phân hủy. Người và hầu hết động vật không có khả năng phân hủy cellulose. Do đó, khi hệ thực vật chết hoặc con người thải các sản phẩm hữu cơ có nguồn gốc thực vật đã để lại trong môi trường lượng lớn rác thải hữu cơ. Tuy nhiên nhiều chủng vi sinh vật (nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn) cỏ khả năng phân hủy cellulose thành các sản phẩm dễ phân hủy và cuối cùng thành glucose nhờ enzym cellulase. Trong nông nghiệp cellulase sẽ giúp sự phân hủy cellulose từ các phế phụ phẩm tạo thành phân bón hữu cơ làm giảm ô nhiễm môi trường cũng như thoái hóa đất.
Chitinase là enzym thủy phân chitin, chitin phân bố rộng rãi ở dạng cấu trúc cơ bản trong thành tê bào của nấm. Chitinase do vi sinh vật sinh ra co mặt trong các môi trường khác nhau như nước, đất và phân bón….. Chitinase và β – glucanase được tạo ra trong mô thực vật khi tế bào bị kích thích bởi nấm gây bệnh chứa chitin, xúc tác sự thủy phân vách tế bào nấm và ngăn cản sự phát triển của bệnh. Việc bổ sung chitin vào đất hoặc lên tán lá làm tăng số lượng vi khuẩn phân giải chitin cũng có tác dụng hạn chế mầm bệnh.
Do đó đề tài tiến hành nghiên cứu xác định khả năng hoạt độ enzym của 10 dòng vi khuẩn, xạ khuẩn có tiềm năng. Kết quả thu được như sau:
Bảng 4.16. Định tính hoạt độ enzym của các dòng vi khuẩn và xạ khuẩn triển vọng
TT Ký hiệu nguồn VK, XK Đường kính vòng phân giải (cm) Cellulase Chitinase β - Glucanase
1 F-29.1 VK 3,23b 3,57bc 3,17b 2 F-90.1 VK 2,93ab 2,87a 2,37a 3 F-97.5 VK 3,17b 3,33ab 3,17b 4 F-100.5 VK 4,53c 3,60bc 3,63b 5 F-116 VK 2,96ab 3,40abc 3,23b 6 VF-6 VK 3,27b 2,90a 3,00ab 7 VF-7 VK 3,27b 3,23ab 3,07b 8 F-112 XK 2,53a 3,17ab 3,50b 9 F-123 XK 3,10ab 3,63bc 3,17b 10 F-129 XK 3,47b 4,03c 3,37b Đối chứng 0,00 0,00 0,00 LSD 0.05 0,62 0,63 0,64 CV(%) 2,1 2,4 2,6
Kết quả bảng 4.16 cho thấy 10 loại vi khuẩn, xạ khuẩn đều có các enzyme cellulase, chitinase và β – Glucanase có khả năng phân giải tốt. Đặc biệt các nguồn VF-7, F-29.1, F-100.5, F-123 và F-129hoạt độ của 3 loại enzyme đều tốt,
Hình 4.15. Khả năng hoạt hóa enzyme chitinase của một số dòng vi khuẩn, xạ khuẩn
Hình 4.16. Khả năng hoạt hóa enzyme β-glucanase của một số dòng vi khuẩn, xạ khuẩn
Hình 4.17. Khả năng hoạt hóa enzyme cellulose của một số dòng VK, XK
4.3.4.6. Khả năng thủy phân tinh bột của các dòng VK, XK có triển vọng
Bảng 4.17. Khả năng thủy phân tinh bột của các dòng vi khuẩn, xạ khuẩn có triển vọng
Ký hiệu nguồn VK, XK Khả năng thủy phân tinh bột
F-29.1 VK + F-90.1 VK + F-97.5 VK + F-100.5 VK + F-116 VK + VF-6 VK + VF-7 VK + F-112 XK + F-123 XK + F-129 XK + Ghi chú:
+: Có khả năng thủy phân tinh bột
Kết quả Bảng 4.17 cho thấy tất cả các dòng VK, XK có triển vọng đều có khả năng thủy phân tinh bột.
Hình 4.18. Khả năng thủy phân tinh bột của một số dòng VK và XK
4.3.4.7. Độc tính của các dòng VSV với chuột bạch
Từ các kết quả thí nghiệm trong phòng ở trên trong phạm vi nghiên cứu này chúng tôi chỉ tập trung nghiên cứu sâu hơn về vi khuẩn VF-7 và xạ khuẩn F- 123, để xác định xem 2 dòng vi sinh vật này có đủ điều kiện sử dụng sản xuất chế phẩm vi sinh đối kháng hay không. Đề tài tiến hành thử độc tính của chúng trên chuột bạch, kết quả như sau:
Bảng 4.18. Đánh giá khả năng gây độc bán trường diễn của các chủng vi sinh vật đối kháng và thảo mộc trên chuột (Sau 30 ngày)
TT VSV đối kháng
Các triệu chứng quan sát theo thời gian (ngày)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 1 VF-7 bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt 2 F-123 bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt 3 ĐC bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt bt
Ghi chú: (bt) bình thường, không có triệu chứng lạ.
Qua kết quả theo dõi sau 24 giờ cũng như sau 30 ngày cho thấy tất cả số chuột thí nghiệm ở các công thức đều phát triển bình thường, không có hiện tượng ngộ độc cấp tính xảy ra. Bên cạnh đó cũng theo dõi trọng lượng của chuột và giải phẫu các cơ quan nội tạng thì thấy rằng chuột vẫn phát triển, tăng trọng lượng ở tất cả các công thức. Cơ quan nội tạng của chuột, đặc biệt là gan không có một biểu hiện triệu chứng bất thường nào, không có hiện tượng xuất huyết hay hoại tử.
Theo dõi trọng lượng của chuột ở công thức uống dịch vi sinh vật và thảo mộc ở nồng độ cao nhất (1010 cfu/ml với vi sinh vật đối kháng và 5% với thảo mộc) ở các ngày sau uống có kết quả thể hiện ở Bảng 4.18.
Bảng 4.19. Trọng lượng chuột ở các ngày sau uống
TT VSV đối kháng và thảo mộc Mật độ tế bào VK, XK trong dịch uống (cfu/ml) Trọng lượng chuột trước khi uống dịch (gr)
Trọng lượng của chuột ở các ngày sau uống dịch (gr) 5 ngày 10 ngày 15 ngày 20 ngày 25 ngày 30 ngày 1 VF7 1010 27,2a 29,1a 31,4a 34,0a 36,7a 39,2a 41,7a 2 F123 1010 28,6a 31,1a 33,1a 34,9a 36,9a 39,5a 42,3a 6 Đối chứng 1010 27,8a 29,8a 31,7a 34,7a 37,3a 39,3a 42,0a CV% 17,5 16,3 18,5 17,7 20,0 19,7 19,9
Trọng lượng của chuột ở mỗi ngày theo dõi với các công thức là không có sự sai khác, chuột phát triển bình thường và trọng lượng không có sự sai khác so với đối chứng chuột không uống. Sau 30 ngày uống dịch trọng lượng trung bình của chuột ở công thức thí nghiệm VK VF7 tăng 14,47gr, công thức sử dụng XK F123 tăng 13,77gr trong khi công thức uống nước lọc tăng 14,2gr. Như vậy dòng vi khuẩn VF7 và xạ khuẩn F123 có thể sử dụng để sản xuất chế phẩm vi sinh đối kháng.