2.6.1. Phương pháp truyền thống
2.6.1.1. Phương pháp nhân giống hữu tính
Phương pháp nhân giống hữu tính là phương pháp nhân giống bằng hạt. * Những ưu điểm của phương pháp nhân giống bằng hạt.
1.Kỹ thuật đơn giản, dễ làm. 2.Hệ số nhân giống cao.
3.Tuổi thọ của cây trồng bằng hạt thường cao.
4.Cây trồng bằng hạt thường có khả năng thích ứng rộng với điều kiện ngoại cảnh.
* Những nhược điểm của phương pháp nhân giống bằng hạt
1. Cây giống trồng từ hạt thường khó giữ được những đặc tính của cây mẹ.
2.6.1.2. Phương pháp nhân giống vô tính Phương pháp chiết cành
- Cơ sở khoa học của phương pháp là sau khi ta tiến hành khoanh vỏ, dưới ảnh hưởng của các chất nội sinh trong tế bào như auxin, cytokinin khi gặp những điều kiện nhiệt độ, độ ẩm thích hợp thì dễ được hình thành và chọc thủng biểu bì đâm ra ngoài.
1. Những ưu điểm của phương pháp chiết cành
- Cây giống giữ nguyên được đặc tính di truyền của cây mẹ.
- Cây sớm ra hoa kết quả, rút ngắn được thời gian kiến thiết cơ bản. - Thời gian nhân giống nhanh.
- Cây trồng bằng cành chiết thường thấp, phân cành cân đối, thuận lợi cho chăm sóc và thu hoạch.
2. Những nhược điểm của phương pháp chiết cành
a. Hệ số nhân giống không cao, chiết nhiều cành trên cây sẽ ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển của cây mẹ.
b. Đối với một số giống cây ăn quả, dùng phương pháp chiết cành cho tỷ lệ ra rễ thấp.
a. Phương pháp giâm cành
- Giâm cành là phương pháp nhân giống cây trồng bằng cơ quan sinh dưỡng. Cơ sở khoa học của phương pháp tương tự như nhân giống bằng phương pháp chiết cành.
3. Những ưu điểm của phương pháp giâm cành - Giữ nguyên được đặc tính di truyền của cây mẹ. - Tạo ra cây giống sau trồng sớm ra hoa kết quả. - Thời gian nhân giống nhanh.
- Có thể nhân nhiều giống mới từ một nguồn vật liệu giới hạn ban đầu.
b. Phương pháp tách chiết cây lan con (cây keiki).
- Keiki là tiếng Ha Uy Di (Hawaii) có nghĩa là bé con (baby). Những cây con này thừa hưởng đặc tính di truyền nên hoa lá sẽ giống y như cây mẹ.
Khi cây mọc quá mạnh, tình trạng này thường xẩy ra, với các loài đơn thân như cây Renanthera citrina bên cạnh ra tới 3 cây con, một ở trên thân và 2 ở dưới gốc.
Những cây Dendrobium khi cần khô nước để chuẩn bị ra hoa, chúng ta lại tưới quá nhiều thường sinh ra nhiều cây con ở trên cành.
Còn những cây Dendrobium ở vào tình trạng sắp chết, vì bản năng sinh tồn, cây mẹ phải sinh ra cây con trước khi từ giã cuộc đời. Muốn tách những cây con này ra, nên đợi tới khi cây có tối thiêu 3 rễ, nhưng rễ này phải dài 3 – 4cm và rễ phải có đầu xanh. Nếu rễ quá ngắn hoặc không có đầu xanh nên lấy rêu phủ lên để tăng thêm độ ẩm, rễ sẽ mọc dài ra.
Khi đó nhẹ nhàng tách cây con ra khỏi cây mẹ, hay tốt hơn là lấy dao hay kéo sắc, đã khử trùng cắt ở dưới gốc cây keiki một đốt hay là nếu nhiều cây nên cắt luôn một khúc, sau đó chấm vào thuốc mọc rễ và đem trồng với hỗn hợp: 80% vỏ thông, 10% than củi và 10% perlite đã ngâm trong nước 24 giờ. Để vào chỗ rợp mát và một tuần sau mới tưới rất ít. Sau đó dần dần mang cây ra chỗ sáng hơn và khi thấy cây mọc mạnh, tưới nước và bón phân đều đặn.
Không nên tách cây con vào cuối thu hay mùa đông vì thời gian này cây không mọc nên thường hay bị chết.
2.6.2. Phương pháp nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào thực vật
- Nhân giống bằng nuôi cấy mô tế bào là phương pháp nhân giống vô tính tiên tiến nhất hiện nay. Bộ phận để nhân giống có thể là ngọn cây, ngọn cành, nhánh một phần của lá, hoa, rễ cây. Nhân giống hoa ở các nước tiên tiến đều sử dụng phương pháp nuôi cấy mô tế bào đối với cây hoa lan, cúc, cẩm chướng, đồng tiền, loa kèn, layơn….
- Ưu điểm của phương pháp nhân giống bằng in vitro
a) Cây được sản xuất từ nuôi cấy mô tế bào là sạch bệnh, cây sinh trưởng, phát triển khoẻ, độ đồng đều cao.
b) Hệ số nhân giống cao so với các phương pháp nhân giống khác.
- Nhược điểm của phương pháp nhân giống bằng in vitro c) Phải đầu tư các phương tiên kỹ thuật, hoá chất.
d) Giá thành cây con giống cao, khó áp dụng.
2.7. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO HOA LAN HOÀNG THẢO VÔI ĐỎ HOÀNG THẢO VÔI ĐỎ
Hiện nay, lan Hoàng thảo Vôi Đỏ vẫn đang được sản xuất rất hạn chế cả trong nước lẫn trên thế giới,chủ yếu vẫn là hàng nhập từ Đài Loan, Trung Quốc
về. Sở dĩ còn rất hạn chế loài lan này vì nó là một loài hoa lan còn rất mới mẻ và được lai tạo từ 2 giống lan dendrobium aphyllum và dendrobium primulinum. Tại Việt Nam, lan hoàng thảo Vôi Đỏ gần như chưa được đưa vào sản xuất, nguồn hàng bán trên thị trường đều nhập khẩu từ nước ngoài. Một số tổ chức nhà nước hoặc tư nhân như Viện Di truyền Nông nghiệp, công ty Orchid Life’s Beautiful... đã và đang tiến hành nghiên cứu nhân nhanh in vitro lan Hoàng thảo Vôi đỏ, tuy nhiên hiệu quả tạo ra cây con còn thấp nên cũng chưa thể đưa vào sản xuất. Khắc phục điều này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu xây dựng quy trình nhân nhanh in vitro giống lan hoàng thảo Vôi Đỏ (Dendrobium Jan Orinstein red and white).
PHẦN 3. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu
- Giống lan Hoàng thảo Vôi đỏ nhập nội từ Đài Loan và được trồng tại vườn tập đoàn các giống lan - Viện Di truyền Nông nghiệp.
3.1.2. Vật liệu nghiên cứu
- Là lá non, chồi đỉnh, các đoạn thân mang mắt ngủ của cây Hoàng thảoVôi đỏ. Môi trường khoáng nuôi cấy được sử dụng là môi trường VW cải tiến (Vacine and Went, 1949), 30g/l đường sucrose, có bổ sung vitamin và một số chất điều hòa sinh trưởng với nồng độ thay đổi tùy theo mục đích của mỗi thí nghiệm, pH=5,8.
3.1.3. Thời gian, địa điểm nghiên cứu
- Từ tháng 3/2016 – 4/2017;
3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3.2.1. Tạo mẫu nuô cấy vô trùng 3.2.1. Tạo mẫu nuô cấy vô trùng
- Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của chất khử trùng khác nhau đến hiệu quả khử trùng của mẫu nuôi cấy
+ Thí nghiệm 1.1: Nghiên cứu ảnh hưởng của Nồng độ chất khử trùng đến hiệu quả khử trùng của mẫu lá non nuôi cấy.
Hóa chất Công thức mt Nồng độ (%) Thời gian(phút) Số mẫu ban đầu Mẫu lá non Tỉ lệ mẫu đạt (%) Tỉ lệ mẫu không đạt (%) HgCl2 CT1 0,1 5 CT2 0,1 10 CT3 0,1 15 CT4 0,1 20 H2O2 CT5 5 10 CT6 10 10 CT7 15 10 CT8 20 10
Môi trường hồi phục sau khử trùng: VW + 30 g/L sucrose + 10% nước dừa (ND) + 10% chuối xanh (CX) + 0,5g/L than hoạt tính (AC) + 5,5 g/L agar, pH = 5,8.
+ Thí nghiệm 1.2: Nghiên cứu ảnh hưởng của Nồng độ chất khử trùng đến hiệu quả khử trùng của mẫu chồi đỉnh nuôi cấy
Hóa chất Công thức mt Nồng độ (%) Thời gian (phút) Số mẫu ban đầu Mẫu chồi đỉnh Tỉ lệ mẫu đạt (%) Tỉ lệ mẫu không đạt (%) HgCl2 CT1 0,1 5 CT2 0,1 10 CT3 0,1 15 CT4 0,1 20 H2O2 CT5 5 10 CT6 10 10 CT7 15 10 CT8 20 10
Môi trường hồi phục sau khử trùng: VW + 30 g/L sucrose + 10% nước dừa (ND) + 10% chuối xanh (CX) + 0,5g/L than hoạt tính (AC) + 5,5 g/L agar, pH = 5,8.
+ Thí nghiệm 1.3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ chất khử trùng đến hiệu quả khử trùng của mẫu đoạn thân.
Hóa chất Công thức mt Nồng độ (%) Thời gian(phút) Số mẫu ban đầu
Mẫu đoạn thân Tỉ lệ mẫu đạt(%) Tỉ lệ mẫu không đạt (%) HgCl2 CT1 0,1 5 CT2 0,1 10 CT3 0,1 15 CT4 0,1 20 H2O2 CT5 5 10 CT6 10 10 CT7 15 10 CT8 20 10
Môi trường hồi phục sau khử trùng: VW + 30 g/L sucrose + 10% nước dừa (ND) + 10% chuối xanh (CX) + 0,5g/L than hoạt tính (AC) + 5,5 g/L agar, pH = 5,8.
- Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nguồn mẫu đến sinh trưởng của mẫu nuôi cấy. - Mục đích của thí nghiệm: quan sát, so sánh và xác định được nguồn mẫu đưa vào tối ưu nhất từ thí nghiệm 1 để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Nguồn mẫu Tỷ lệ sống(%) Nhận xét
Lá non Chồi đỉnh Đoạn thân
Môi trường nền chung: VW + 30 g/L sucrose + 10% nước dừa (ND) + 10% chuối xanh (CX) + 0,5g/L than hoạt tính (AC) + 5,5 g/L agar, pH = 5,8.
Thí nghiệm3: Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng của mẫu nuôi cấy.
Mục đích của thí nghiệm: Xác định được môi trường nuôi cấy tối ưu cho sinh trưởng của mẫu nuôi cấy. Sử dụng nguồn mẫu được xác định thừ thí nghiệm trước.
Thí nghiệm được nghiên cứu trong điều kiện tối ưu về nhiệt độ, pH, ánh sáng.
Công thức 1 (VW): Môi trường khoáng Vacin and Went (1949)
Công thức 2 (VW1): môi trường VW tăng gấp đôi lượng KNO3 và NH4SO4.
Công thức 3 (VW2): môi trườngVW1 bổ sung thêm vitamin của môi trường MS (Murashige & Skoog, 1962).
Công thức 4 (MS/2): môi trường MS giảm đi 1 nửa.
Môi trường nền: 30 g/l Sucrose + 10% ND + 10% CX + 0,5 g/l AC + 5,5 g/l agar, pH 5,8.
Loại môi trường tối ưu sẽ được chọn làm môi trường nền tối ưu (NTU) cho các thí nghiệm tiếp theo. Môi trường nền tối ưu ký hiệu là NTU.
Môi trường nền chung: NTU +30 g/L sucrose + 10% nước dừa (ND) + 10% chuối xanh (CX) + 0,5 g/L AC + 5,5 g/L agar, pH = 5,8.
- Thí nghiệm 4:Nghiên cứu ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự phát sinh hình thái của mẫu nuôi cấy.
Mẫu được lựa chọn sinh trưởng trong loại môi trường được xác định là tốt nhất ở thí nghiệm 3.
Công thức 1 (B1) Nồng độ 6-BA bổ sung : 0mg/l môi trường Công thức 2 (B2) Nồng độ 6-BA bổ sung : 0,5mg/l môi trường Công thức 3 (B3) Nồng độ 6-BA bổ sung : 1mg/l môi trường Công thức 4 (B4) Nồng độ 6-BA bổ sung : 2mg/l môi trường Công thức 5 (B5) Nồng độ 6-BA bổ sung : 2,5mg/l môi trường Công thức 6 (B6) Nồng độ 6-BA bổ sung : 3mg/l môi trường Môi trường nền chung: NTU + 30 g/L sucrose + 10% nước dừa + 10% CX + 0,5 g/L AC + 5,5 g/L agar, pH =5,8.
3.2.2. Nghiên cứu phương pháp nhân nhanh thông qua protocorn ở các đ ều k ện nuô cấy khác nhau
Sau khi xác định môi trường tạo protocorm, tiến hành thu nhận protocorm với chất lượng cum xanh khỏe, không có hiện tượng thủy tinh hóa và mọng nước để tiến hành thí nghiệm này.
Công thức 1: 0mg/l 6-BA Công thức 2: 1mg/l 6-BA Công thức 3: 2mg/l 6-BA Công thức 4: 3mg/l 6-BA Công thức 5: 4mg/l 6-BA Công thức 6: 5mg/l 6-BA
Môi trường nền chung: NTU + 30 g/L sucrose + 10% ND + 10% CX + 0,5 g/L AC + 5,5 g/L agar, pH 5,8.
- Thí nghiệm 6 : Đánh giá ảnh hưởng của 6-BA kết hợp với kinetin lên khả năng nhân protocorm.
Nồng độ 6-BA được xác định là tốt nhất cho quá trình nhân nhanh protocorm ở thí nghiệm 6 được sử dụng để đánh giá tiếp cho thí nghiệm 6. Mẫu được sử dụng từ thí nghiệm trên.
Công thức 1 :Nồng độ kinetin bổ sung : 0,0mg/l môi trường Công thức 2 :Nồng độ kinetinbổ sung : 0,1mg/l môi trường Công thức 3 :Nồng độ kinetinbổ sung : 0,2mg/l môi trường Công thức 4 :Nồng độ kinetinbổ sung : 0,3mg/l môi trường Công thức 5 :Nồng độ kinetinbổ sung : 0,4mg/l môi trường Công thức 6 :Nồng độ kinetin bổ sung : 0,5mg/l môi trường Môi trường nền chung: NTU + 6-BA(thí nghiệm 5) + 30 g/L sucrose + 10% ND + 10% CX + 0,5 g/L AC + 5,5 g/L agar, pH =5,8.
3.2.3. Ngh ên cứu phương pháp tá s nh cây và tạo cây hoàn chỉnh
- Thí nghiệm7: Nghiên cứu môi trường tái sinh cây.
+Thí nghiệm 7.1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ 6-BA đến khả năng tái sinh và nhân chồi. Mẫu thu được từ các thí nghiệm tối ưu môi trường nhân nhanh protocorm được sử dụng cho các thí nghiệm trong giai đoạn này.
Công thức 2: 0,25mg/l 6-BA Công thức 3: 0,5mg/l 6-BA Công thức 4: 0,75mg/l 6-BA Công thức 5: 1mg/l 6-BA Công thức 6: 1,25mg/l 6-BA
Môi trường nền chung: NTU + 30 g/L sucrose + 10% ND + 10% CX + 0,5 g/L AC + 5,5 g/L agar, pH 5,8.
+ Thí nghiệm 7.2: Ảnh hưởng của nồng độ kết hợp 6-BA và kinetin đến khả năng tái sinh và nhân chồi
Công thức 1: 0mg/l kinetin Công thức 2: 0,1mg/l kinetin Công thức 3: 0,2mg/l kinetin Công thức 4: 0,3mg/l kinetin Công thức 5: 0,4mg/l kinetin Công thức 6: 0,5mg/l kinetin
Môi trường nền chung: NTU + 6-BA (thí nghiệm 7.1) + 30 g/L sucrose + 10% ND + 10% CX + 0,5 g/L AC + 5,5 g/L agar, pH 5,8
- Thí nghiệm 8 : Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường đến sinh trưởng và phát triển của cây con in vitro
+ Thí nghiệm 8.1: Nghiên cứu ảnh hưởng của GA3 đến khả năng kéo dài chồi của cây con in vitro. Lựa chọn cây con đã được tái sinh từ thí nghiệm 7 để làm vật liệu cho thí nghiệm này.
CT1: 0mg/l GA3 CT2: 0,1mg/l GA3 CT3: 0,2mg/l GA3 CT4: 0,3mg/l GA3 CT5: 0,4mg/l GA3 CT6: 0,5mg/l GA3 CT7: 1mg/l GA3
Môi trường nền chung: NTU + 6-BA( thí nghiệm 7.1) + kinetin (thí nghiệm 7.2) + 30 g/L sucrose + 10% ND + 10% CX+ 0,5 g/L AC + 5,5 g/L agar, pH =5,8. + Thí nghiệm 8.2: Nghiên cứu ảnh hưởng của α-NAA đến sự hình thành rễ của cây con in vitro. Sử dụng cây con cho kết quả tốt nhất ở thí nghiệm 8.1 để làm vật liệu cho thí nghiệm này.
CT1: 0mg/l NAA CT2: 0,2mg/l NAA CT3: 0,4mg/l NAA CT4: 0,6mg/l NAA CT5: 0,8mg/l NAA CT6: 1mg/l NAA
Môi trường nền chung: NTU + 30 g/L sucrose + 10% ND + 10% CX + 0,5 g/L AC + 5,5 g/L agar, pH =5,8.
+ Thí nghiệm 8.3: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ nước Dừa đến quá trình sinh trưởng của cây con in vitro.
Cây con cho kết quả tốt nhất ở thí nghiệm 8.2 được sử dụng cho thí nghiệm này CT1: 0ml/l
CT2: 50ml/l CT3: 100ml/l CT4: 200ml/l
Môi trường nền chung: NTU + α-NAA (thí nghiệm 8.2) + 30 g/L sucrose + 10% CX + 0,5 g/L AC + 5,5 g/L agar, pH =5,8.
3.2.4. Nghiên cứu phương pháp huấn luyện và đưa cây in vitro ra ngoà vườn ươm vườn ươm
Thí nghiệm 10: Nghiên cứu ảnh hưởng của một số biện pháp huấn luyện cây in vitro trong bình trước khi ra ngôi
Cây con thu thập được khi đã đạt được các chỉ tiêu về chiều cao, lá, rễ … tiến hành cho ra vườn ươm.
Công thức 1: Cây đưa từ in vitro ra ngôi ngoài vườn ươm ngay.
Công thức 2: Bình cây để ở hành lang 3 ngày sau lấy ra và đưa ra vườn ươm.
Công thức 3: Bình cây để ở hành lang 3 ngày sau đó mang ra nhà lưới 3 ngày trước khi ra ngôi.
Công thức 4: Bình cây để ở hành lang 3 ngày sau đó mang ra nhà lưới mở nắp bình 3 ngày trước khi ra ngôi.
Thí nghiệm 11: Nghiên cứu ảnh hưởng của các loại giá thể khác nhau lên tỷ lệ sống sót khi ra cây trong nhà lưới
Các loại giá thể thông dụng : CT1: vỏ thông
CT2: rong biển CT3: than củi
3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Các thí nghiệm khởi tạo thể tiền chồi, nhân thể tiền chồi và tạo cây hoàn chỉnh từ thể tiền chồi được thử nghiệm trên các nền môi trường khác nhau bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng thực vật và phụ gia như nước dừa và chuối xanh ở các hàm lượng khác nhau. Môi trường khoáng nuôi cấy được sử dụng là